Определение массовой доли белка методом Лоури в модификации Дэвени и Гергей
Метод Лоури основан на реакции взаимодействия фенольного реактива Фолина – Чокалтеу с щелочными растворами белков, приводящей к образованию продуктов реакции синего цвета. Интенсивность окраски зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны 750 нм.
Метод рекомендуется для определения массовой доли белка в сильно разбавленных растворах, при наблюдении за ходом ферментативных процессов, для определения белков молока, фракционированных растительных белков.
Реактивы: Реактив А. Раствор Na2CO3 массовой долей 2 % в растворе NaOH концентрацией 0,1 моль/дм3. Реактив В. Раствор CuSO4 • Н2О массовой долей 0,5 % в растворе тартрата натрия с массовой долей 1 %. Реактив С. Получают смешиванием 60 см3 реактива А и 1 см3 реактива В (готовят непосредственно перед определением). Реактив Д. Непосредственно перед использованием реактив Фолина – Чокалтеу титруют по фенолфталеину раствором гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раствора 1 моль/дм3
Рис. 7. Зависимость логарифма молекулярной массы (lgМr) белков от объема элюата (Vе): 1-голубой декстран; 2-бычий альбумин; 3-пероксидаза; 4- трипсин; 5-лизоцим
Проведение анализа. К 0,2 см3 исследуемого раствора, содержащего 5 – 100 мкг белка, прибавляют 1 см3 реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см3 реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре (20 ±5) оС на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при λ = 750 нм.
Построение градуировочного графика. Содержание белка в растворе определяют по графику, который строят с использованием раствора тирозина известной концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм3. Градуировочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией (табл. 7).
Таблица 7
Концентрации растворов для построения градуировочного графика
|
Содержание тирозина, мкг |
Объем раствора тирозина, см3 |
Объем раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 мкмоль/дм3, см3 |
Значение экстинции |
|
10 |
0,1 |
0,9 |
0,113 |
|
20 |
0,2 |
0,8 |
0,208 |
|
30 |
0,3 |
0,7 |
0,316 |
|
40 |
0,4 |
0,6 |
0,401 |
|
50 |
0,5 |
0,5 |
0,511 |
|
60 |
0,6 |
0,4 |
0,614 |
|
70 |
0,7 |
0,3 |
0,706 |
|
80 |
0,8 |
0,2 |
0,817 |
|
90 |
0,9 |
0,1 |
0,900 |
Анализ фракционного состава белка на основе их растворимости по Биуретовому методу
Для анализа белковых веществ используют много методов, включая различные модификации метода Кьельдаля, фотометрические методы с использованием спектрофотометров и фотоэлектроколориметров.
Среди ускоренных фотометрических методов большое признание получила биуретовая реакция.
На основе информации о количественном соотношении белковых фракций можно провести реальное прогнозирование функционально-технологических свойств сырья, особенно при получении продуктов заданного качества.
Определение фракционного состава
белков растительного происхождения
на основе их способности к растворению
Аппаратура и реактивы. Дистиллированная вода; сывороточный альбумин; биуретовый реактив; фотоэлектроколориметр (ФЭК-56М); настольная центрифуга; часовое стекло; пипетки; пробирки; технические весы; мерные цилиндры вместимостью 10 см3.
Приготовление реактивов. Биуретовый реактив. 1,5 г CuSO4 5Н2О и 6,0 г NaKC4H4O6 - 4Н2О растворяют в 500 см3 воды, при постоянном перемешивании добавляют 300 см3 раствора гидроксида натрия массовой долей 10 %. Общий объем доводят дистиллированной водой до 1000 см3.
Количественное соотношение различных фракций, их состояние определяют не только технологические свойства сырья и продуктов, но и их биологическую ценность.
Подготовка проб к анализу. Навеску зерна 3 – 4 г тщательно измельчают. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду (альбумины), солевой раствор KCl (глобулины), водно- спиртовый раствор с объемной долей 70 % (проламины), раствор щелочи (глютелины) в соотношении 1 : 6 (по массе) и проводят экстрагирование в течение 1 часа при периодическом перемешивании. Затем центрифугированием при частоте вращения 2000 с-1 в течение 10 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.
Проведение анализа. Для проведения цветной реакции к 1 см3 исследуемых растворов белков (фракции: водорастворимая, солерастворимая и щелочерастворимая) добавляют 4 см3 биуретового реактива. Смесь оставляют в покое при температуре (20 ± 5) оС в течение 30 мин. По истечении времени образования окрашенного комплекса измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540 – 560 мкм на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром.
Для того чтобы определить содержание белка в любой зерновой фракции, нужно снять показания оптической плотности, найти это значение на оси ординат калибровочного графика и определить соответствующую концентрацию белка на оси абсцисс.
Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика готовят ряд последовательных разведений стандартного раствора белка, в качестве которого используют кристаллический сывороточный альбумин: 0,01 г белка растворяют в 100см3 дистиллированной воды, отбирают 1 см3 и доводят объем до 10 см3.
С пробами из каждого разведения белка проводят биуретовую реакцию в условиях, соответствующих описанию метода, и измеряют оптическую плотность окрашенных растворов. Затем строят график D = f(с), пример которого приведен на рис. 8.