Алгоритм лабораторної роботи.

1. Відтворити в експерименті процес трансамінування використовуючи глутамінову та піровиноградну кислоту.

Принцип методу: полягає в тому, що у процесі ферментативного переносу аміногрупи з глутамінової кислоти на кетокислоту (ПВК) утворюються аланін. Про те, що проходить переамінування роблять висновок по появі аланіну на хромотограмі.

Хід роботи: у дві пробірки відміряють по 0,5 мл розчину глутамінової кислоти, 0,5 мл розчину ПВК, 1 мл розчину вуглекислого калію і 0,25 мл розчину монобромоцтової кислоти.

В 1 пробірку (дослід) додають 0,5 мл свіжої м’язової кашки, у другу пробірку - м’язову кашку, яка попередньо прокип’ячена протягом 1-2 хвилин. Обидві пробірки ставлять у термостат при t = 37^оС на 15 хвилин. Потім у кожну додають по 0,25 мл оцтової кислоти та кип’ятять 2-3 хвилини до повного осадження білків. Вміст пробірок фільтрують.

Фільтрати хроматографують. З цією метою на лінії старту двох смужок фільтровального паперу (дослід та контроль) наносять по краплині фільтратів з пробірок, кожного разу підсушуючи на повітрі. Смужки паперу опускають у пробірки, на дні яких знаходиться фенол, насичений водою. Пробірки у штативі поміщають до термостату на 1 годину при 35-40^оС. Після цього смужки паперу виймають, відмічають лінію фронту (фініш) розчинника, підсушують 10-15 хвилин при 100^оС, а потім проявляють розчином нінгідрину. Знов підсушують.

Для кожної визначеної плями обчислюють коефіцієнт Rf за формулою: Rf = 1/h

де, 1- це відстань від старту до центру плями,

h- відстань від старту до фінішу ( відстань, яку пройшов розчинник).

На основі одержаних даних роблять висновки, хроматограму підклеюють до протоколу.

Rf амінокислот (для фенолу):

Аспарагінова к-та – 0,07	Аргінін – 0,41
Глутамінова к-та – 0,16	Тирозин – 0,52
Цистеїн – 0,19	Аланін – 0,55
Гліцин (глікокол) – 0,30	Фенілаланін – 0,78
Метіонін – 0,39	Лейцин – 0,79

\2. Визначення активності амінотрансфераз.

Принцип методу. Амінотрансферази – ферменті які вміщують у якості коферментів фосфопірідоксамін, каталізують зворотній перенос аміногруп з амінокислот на α – кетокислоти. Визначення концентрації α – кетокислот, які утворюються при трансамінуванні лежить в основі дінітрофенілгідразінового методу визначення активності трансаміназ.

Техніка роботи. Визначення аспартатамінотрансферази (АсАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АсАТ, витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин.

Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються при λ = 560нм.

Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АлАТ, витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 30 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідрозіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин. Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються. Контрольні проби обробляють так, як дослідні, але сироватку додають після інкубації проб.

Розрахунок активності ферментів проводять по калібровочному графіку. При будові калібровочного графіку на осі ординат відкладають значення оптичної щільності, а на осі абсцис - вміст ПВК.

Фізіологічні рівні: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при t =37^оС.