Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
модуль ІІ-ІІІ стомат. ф-т.doc
Скачиваний:
65
Добавлен:
06.03.2016
Размер:
965.12 Кб
Скачать

Алгоритм лабораторної роботи.

Кількісне визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

Принцип методу: визначається оптична густина розчину гідразону кетоглутарату та пірувату, які утворюються при взаємодії аланіну (або аспартату) з кетоглутаратом. Визначення проводять в 1 см кюветі при довжині хвилі λ – 500-530 нм. При визначенні АсАТ – піруват утворюється шляхом декарбоксилювання оксалоацетату.

Реактиви:

  1. Еталонний 2 мМ розчин пірувату.

  2. 1 мМ розчин 2,4-дінітрофенілгідразіну в 1 М НCl.

  3. Розчин NаОН (16 ч. в 1000 мл Н2О).

  4. Субстрат АсАТ: а) 0,1 мМ розчин аспартату;

б) 0,2 мМ розчин кетоглутарату;

в) фосфатний буфер рН-7,4.

  1. Субстрат АлАТ: а) 0,2 мМ розчин аланіну;

б) 0,2 мМ розчин кетоглутарату;

в) фосфатний буфер рН-7,4.

Визначення активності АсАТ.

Реактиви, послідовність дії

Дослідна проба

Контроль

Реактив 4

0,25 мл

0,25 мл

Фізіологічний розчин

---

0,05 мл

Сироватка крові

0,05 мл

---

Інкубація до 60 хв. При t = 23 о

+

+

Реактив 2

0,25 мл

0,25 мл

Перемішуємо і залишаємо на 20 хв. при t = 23 о

+

+

Розчин лугу

2,5 мл

2,5 мл

Перемішуємо і через 10 хв. визначаємо оптичну густину дослідної проби проти контролю в кюветі 1см при довжині хвилі λ – 500-530 нм.

Визначення активності АлАТ проводять по тій же схемі, але замість реактиву 4, беруть реактив 5.

Для розрахунку активності будують калібровочний графік з розчинами 1 і 2.

В сироватці крові здорової людини активність:

АсАТ = 0,1 – 0,45 мМ / г / л

АлАТ = 0,1 – 0,68 мМ / г / л

Тема 5. Дослідження ролі кофакторів та коферментних вітамінів у каталітичній активності ферментів.

Актуальність теми.

Ферменти як каталізатори беруть участь в усіх без виключення біохімічних процесах, які лежать в основі життєдіяльності живої матерії. Коферменти входять до складу більшості ферментів і практично визначають активність останніх.

Коферментні (активні) форми водорозчинних вітамінів беруть участь в регуляції життєво важливих біологічних процесів, а також знаходять широке застосування в клінічній практиці для корекції порушень процесів метаболізму.

Мета та вихiдний piвень знань.

Загальна мета: вміти трактувати біохімічні закономірності функціонування вітамінів (та їх коферментних форм) як компонентів харчування людини та регуляторів ферментативних реакцій і обмінних процесів. Вміти чітко дослідити взаємозв’язок патогенезу розладів при різних гіповітамінозах с функціонуванням певних ланок обміну речовин.

Конкpетна цілі: мати чітку уяву про біологічні функції водорозчинних коферментних вітамінів В2, РР, В6. Вміти писати формули найбільш важливих коферментів, та розуміти принципи та мету визначення в біологічних рідинах їх попередників.

Вихiдний piвень знань-вмiнь. Інтерпретувати механізми участі вітамінів в побудові коферментів, що каталізують біохімічні реакції в організмі (на прикладі НАД+).