5 Экспрессия рекомбинантных генов.

5.1 Вводная часть.

Основная цель экспериментаторов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонируемый вектор, ещё не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение продукта было оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким.

Для достижения эффективной экспрессии уже скон­струировано много специальных векторов. Для этого проводились манипуляции с целым рядом генетических элементов. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны сле­дующие: тип промотора и терминатора транс­крипции; прочность связывания мРНК с ри­босомой; эффективность транс­ляции в организме хозяина; стабильность продукта в хозяйской клетке; конечная локализация син­тезируемого продукта.()

Никакой универсальной стратегии оптимиза­ции экспрессии клонированных генов не сущест­вует. Большинство генов имеют уникаль­ные молекулярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них прихо­дится подбирать всякий раз заново. Эффектив­ность экспрессии любого чужеродного гена зави­сит также от его родства с организмом-хозяином. Несмотря на то, что многие представители как про- так эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК ис­пользуют в основном Escherichia coli. Это связа­но, прежде всего, с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганиз­ма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков. ()

5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.

Экспрессия клонированных генов является одной из основных задач генной инженерии. Для получения полноценной экспрессии клонированных генов используют экспрессионные векторные системы, принципы конструирования которых, в настоящее время хорошо разработаны.

Экспрессия генетической информации, заключенной в генах живых организмов осуществляется путем ее переноса от нуклеиновых кислот к белкам по схеме: ДНК  РНК  белок. Любой полноценный в функциональном отношении ген состоит из двух основных частей – регуляторной и структурной. Генетический код, с помощью которого последовательность нуклеотидов в кодирующей структурной части гена определяет последовательность аминокислот в белке, универсален для всех живых организмов. Это дает возможность получения полноценной экспрессии самых разнообразных последовательностей нуклеотидов в любом природном генетическом окружении. Таким образом, универсальность генетического кода является основой для создания функционально активных генно-инженерных конструкций (33).

5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.

Для того чтобы в клетках E. coli произошла экспрессия клонированного гена, этот ген должен быть транскрибирован РНК-полимеразой, а образовавшаяся РНК транслирована рибосомами с образованием нативного белкового продукта. Для эффективной экспрессии в клетках E. сoli ген должен находиться под контролем регуляторных элементов данного микроорганизма. Регуляторная часть генов распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает упорядоченную экспрессию его структурной части. Основным регуляторных элементов является промотор ().

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов.

Для эффективной экспрессии любого гена необходимо наличие сильного регу­лируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилега­ющие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регу­лируемость промотора позволяет осуществлять строгий контроль транскрипции.

Необходимость регулирования экспрессии генов в генной инженерии диктуется, прежде всего, тем, что сверхэкспрессия рекомбинантных белков может отрицательно сказываться на жизнеспособности клеток-продуцентов, поскольку она приводит к истоще­нию энергетических ресурсов клетки и нарушению её метаболизма. Кроме того, продукты экспрессии часто обладают цитотоксическим действием. В этом случае может сильно снижаться скорость роста культуры. Для предотвращения такого рода эффектов используют конструкции, в которых экспрессия клонированных генов подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста клеток и может быть дерепрессирована в любой нужный момент времени.

Наиболее широко используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов Е. coli; специально сконстру­ированный tac-промотор, включающий —10-область lac-промотора и —35-область trp-промото­ра (участки, находящиеся на расстоянии 10 и 35 п. н. до сайта инициации транскрипции); ле­вый, или p^L, промотор бактериофага λ; промо­тор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов ().

Часто для контроля экспрессии клонированных генов используют систему регуляторных элементов лактозного оперона (lac-оперона). В векторную молекулу вводят регуляторную последовательность lac-оперона, за которой следуют последовательности нуклеотидов полилинкера с несколькими уникальными сайтами рестрикции, по которым проводится клонирование исследуемого гена. Одновременно в тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия молекулы репрессора, ген которого экспрессируется конститутивно, связываются с оператором, тем самым, препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции клонированного гена. Для индукции lac-оперона используют синтетический аналог природного индуктора (алло-лактозы) – изопропил–-D-тиогалактопиранозид (IPTG). Индуктор связывается с молекулой репрессора и нарушает его взаимодействие с операторным участком ДНК. Область lac-промотора становится доступной для РНК-полимеразы, которая с высокой эффективностью начинает транскрибировать гены, расположенные вслед за промотором (33).

Промотор trp выключается под действием комплекса триптофан—trp-репрессор, который связывается с trp-оператором и предотвращает транскрипцию trp-оперона. Активация (включе­ние) trp-промотора происходит либо при удале­нии из среды триптофана, либо при добавлении 3-индолилакриловой кислоты.

Работа промотора p^L регулируется репрессорным белком сI бактериофага λ. На самом деле для регуляции транскрипции с p^L-промотора обычно используется термочувствительная мутантная форма репрессора сI — белок cI₈₅₇. Клет­ки, синтезирующие этот репрессор, сначала вы­ращивают при температуре 28—30 °С. В этих условиях репрессор блокирует транскрипцию с p^L-промотора. Когда культура достигает нужной фазы (как правило, середины log-фазы), темпе­ратуру повышают до 42°С, при которой cI₈₅₇-репрессор инактивируется и начинается транс­крипция.

Для транскрипции с промотора бактериофа­га Т7 нужна соответствующая РНК-полимераза. Чтобы можно было использовать этот промотор, ген РНК-полимеразы фага Т7 встраивают в хро­мосому Е. coli в составе профага λ, поместив его под контроль lac-промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой, содержащей ген под контролем Т7-промотора, и добав­ляют в среду ИПТГ. В этих условиях происходит индукция гена РНК-полимеразы Т7, синтези­руется РНК-полимераза и происходят транс­крипция и трансляция клонированного гена. Часто между временем индукции гена РНК-полимеразы Т7 и началом транскрипции гена проходит более часа. Для транскрип­ции с сильного Т7-промотора создана целая серия плазмид, получивших название рЕТ-векторов ().

При культивировании в небольших объемах (от 1 до 5л) индукцию экспрессии осуществляют либо изменением температуры, либо добавлен ием химического индуктора. Однако в опытных установках (20—100 л) и в промышленных био­реакторах (>200 л) температуру нельзя изменить мгновенно, для этого требуется время от 30 до 60 мин, кроме того, на подъем температуры нужна энергия. Поэтому обычно применяют хими­ческий индуктор, например ИПТГ.

Трансляция генов.

Наличие сильного регулируемого промотора – это важное, но недостаточное условие суперэкспрессии белков. Эффективность экспрессии рекомбинантных генов не в меньшей степени зависит и от эффективности трансляции мРНК рибосомами. Чаще всего приходится иметь дело с системами, в которых экспрессируемые ДНК чужеродны по отношению к генетическому окружению и ферментативным системам бактериальных клеток-хозяев.

Различия в трансляции связаны со свойствами имеющегося в транскрибированной РНК сигнала инициации трансляции, называемого сайтом связывания рибосомы. Сайт связывания рибосомы — это последовательность из шести-восьми нуклеотидов (например, UAAGGAGG), спаривающаяся с комплементарной последовательностью (в данном случае AUUCCUCC) малой субъединицы рибосомальная РНК (рРНК). Обычно чем прочнее связывание между мРНК и рРНК, тем выше эффективность инициации трансля­ции. Именно поэтому большинство экспрессионных векторов конструируют таким образом, чтобы мРНК клонированного гена обязательно содержала сильный сайт связыва­ния рибосомы. Это необходимое условие транс­ляции гетерологичных про- и эукариотических генов в Е. coli. Однако должны соблюдаться и некоторые другие условия. Во-первых, нуклеотидная последовательность, связывающаяся с рРНК, должна находиться на определенном расстоянии от старт-кодона клонированного гена (в РНК старт-кодоном является AUG, в ДНК ему соответствует кодон ATG). Во-вто­рых, участок ДНК, содержащий сайт связывания рибосомы и несколько первых кодонов клонированного гена, не должен иметь такую нуклеотидную последовательность, при кото­рой после транскрипции может произойти внутрицепочечное спаривание, наруша­ющее связывание мРНК с рибосомой. Именно локальная вторичная структура мРНК, обеспе­чивающая экранирование или, напротив, экс­понирование сайта связывания рибосомы, и определяет прочность связывания мРНК с ком­плементарной рРНК. Таким образом, при кло­нировании любого гена важно убедиться в том, что сайт связывания рибосомы расположен на нужном расстоянии от этого гена и что вторич­ная структура мРНК не помешает его присоеди­нению к рибосоме.

Из всего вышеизложенного следует, что некодирующая часть мРНК играет важную роль в эффективности ее трансляции рибосомами, и эти особенности их трансляции необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli. Современные экспрессионные вектора построены таким образом, что промотор, а также следующая за ним последовательность нуклеотидов, включающая инициирующий ATG-кодон, являются частью генов, эффективно экспрессирующихся в клетках E. coli. Сразу вслед за ATG-кодоном вектора располагают уникальные сайты рестрикции, по которым проводят встраивание кодирующей части гена, экспрессию которого хотят получить ().

Стабилизация белков.

Следующим важным фактором, определяющим уровень экспрессии рекомбинантных генов, является стабильность кодируемых этими генами белков. Обычно время полужизни белков составляет от нескольких минут до нескольких часов. Такая вариабельность обусловливается различиями в числе дисульфидных связей в белковых молеку­лах и наличием или отсутствием на 5'-конце оп­ределенных аминокислот. Например, если к N-концу β-галактозидазы присоединять разные аминокислоты, то время жизни модифициро­ванного белка in vitro может варьировать от двух минут до более 20 часов. Аминокис­лоты, увеличивающие время жизни белков, можно включать в белки генноинженерными методами. Часто для стабилизации белка-мише­ни достаточно присоединить к N-концу всего один аминокислотный остаток. Долгоживущие белки накапливаются в клетках, что увеличивает конечный выход продукта ().

Локализация рекомбинантных белков в клетке.

Экспрессия эукариотических генов в бактериальных клетках связана с проблемой, что большая часть рекомбинантных эукариотических белков при очень высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя в клетках так называемые тельца включения. Тельца включения представляют собой частицы, состоящие главным образом из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся, как правило, в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует ренатурации. В процессе обработки денатурирующими агентами белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок. Один из подходов, позволяющий повысить растворимость белка внутри клетки, это экспрессировать его в составе гибридного полипептида, другой компонент которого сам по себе обладает высокой растворимостью. Из­вестно, что гибридные белки, одним из компо­нентов которых является тиоредоксин, белок с молекулярной массой 11,7 кД, остаются в растворе, даже если на их долю приходится 40% суммарного клеточного белка. Далее белок-мишень можно отщепить от гибридного белка с помощью энтерокиназы ().

В связи с вышеупомянутыми трудностями выделения белка из ТВ, получение целевого продукта в растворимой форме может существенно упростить схему очистки и тем самым снизить себестоимость конечного препарата. В настоящее время не существует универсального метода, который бы позволял получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных клетках в нативном виде. В некоторых случаях понижение температуры выращивания бактерий приводит к образованию полностью растворимых рекомбинантных белков. Универсальным подходом для получения белков в растворимой форме является обеспечение секреции их в культуральную жидкость. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Выход рекомбинантных белков в культуральную жидкость значительно облегчает их очистку, так как не требуется стадия дезинтеграции клеток и, следовательно, нет загрязнения целевого белка ДНК и белками Е. coli. Кроме того, у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а, следовательно, и в более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Однако при использовании секреционных конструкций, выход целевого белка значительно меньше (на порядок и более), чем при использовании конструкций, позволяющих нарабатывать белок внутри клетки – в тельцах включения или в растворимом виде [].

Образование нерастворимых телец включения в бактериальных клетках в ряде случаев является преимуществом, а не недостатком, поскольку тельца могут облегчать очистку рекомбинантных белков и защищать их от протеолитической деградации.

Системы экспрессии весьма разнообразны, и часто приходится каждый раз подбирать условия, наиболее подходящие для получения того или иного белка. И всё же, несмотря на различие в деталях, для создания самых разнообразных систем экспрессии используются одни и те же основные приёмы.