2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения.

Тельца включения представляют собой частицы, состоящие из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты [].

2.3.1 Отмывка и растворение телец включения

Биомассу замороженных клеток подвергали ультразвуковой дезинтеграции в следующих лизис буферах: a) 50 мМ Tris pH 8.0 и 0.1 % Triton, б) 50 мМ Tris pH 8.0 и 100 мМ NaCI. Нерастворимую фракцию лизата клеток осаждали центрифугированием.

На следующем этапе осуществляли подбор условий растворения отмытых телец включения (Рисунок _ ).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рисунок _ - Подбор условий растворения отмытых телец включения.

1, 3, 5, 7, 9, 11 – супернатант; 2, 4, 6, 8, 10, 12 – осадок.

1, 2. Растворение буфером № 1, культивирование клеток при 25^oC

3, 4. Растворение буфером № 1, культивирование клеток при 37^oC

5, 6. Растворение буфером № 2, культивирование клеток при 25^oC

7, 8. Растворение буфером № 2, культивирование клеток при 37^oC

9, 10. Растворение буфером № 3, культивирование клеток при 25^oC

11, 12. Растворение буфером № 3, культивирование клеток при 37^oC

(Смотри метод 1.9.17 )

Как показывают результаты, частичный переход белка в растворенное состояние наблюдается только в буфере № 3, содержащем 5 M мочевину. Но этого не достаточно для дальнейших исследований и поэтому нами был рассмотрен метод растворения телец включения в буфере № 4 с 3.5 М гуанидингидрохлоридом [].

При использовании данного буфера происходит почти полное растворение телец включения (Рисунок _ ).

Р

37 кДа

50 кДа

исунок _ - Растворение телец включения в буфере с 3.5 М гуанидингидрохлоридом.

1. Б

   25 кДа

   елковый маркер

2. Отмытые тельца включения

3. Р

   20 кДа

   астворение буфером № 4

15 кДа

(Смотри метод 1.9.17 )

10 кДа

1 2 3

Во время денатурации важно, чтобы белок сохранял вторичную структуру. Это является важным фактором с точки зрения эффективности рефолдинга, так как это связано с функциональной способностью молекулы ренатурировать в правильном направлении.

Растворенный гибридный белок в буфере с 3.5 М гуанидингидрохлоридом в дальнейшем использовался для очистки при помощи металло-хелатной аффинной хроматографии.

2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография

SUMO, входящий в состав гибридного белка, содержит последовательность из шести гистидинов (His-таг). Очистка белков, содержащих полигистидиновые последовательности, в техническом плане имеет ряд преимуществ перед белками, не содержащими такие последовательности. Так становится возможным применение металло –хелатной аффинной хроматографии (МХАХ), в основе которой лежит образование прочного комплекса, образующегося между His₆-последовательностью и ионами металла (чаще всего Ni²⁺ или Co²⁺), которыми заряжен хроматоргафический носитель.

На колонку, уравновешенную буфером А, наносили подготовленный образец, после чего промывали колонку тем же буфером А. При этом происходило отмывание всех не связавшихся с колонкой белков E. coli. Все не специфически связавшиеся бактериальные белки удалялись с колонки при повышении концентрации имидазола. Для элюции были опробованы буферы B и С, с содержанием имидазола 50 и 500 мМ соответственно (Рисунок _ ).

75 кДа

1 2 3 4 Рисунок _ - Очистка белка с помощью МХАХ

1. Б

   50 кДа

   елковый маркер

2. П

   37 кДа

   роскок

3. Э

   25 кДа

   люция № 1

4. Элюция № 2

10 кДа

20 кДа

Из рисунка _ видно, что основная часть рекомбинантного белка сходит при элюции с концентрацией имидазола 500 мМ. Использование высокой концентрации имидазола позволяет снизить концентрацию NaCl в буфере для элюции с 500 мМ до 150 мМ, что необходимо для дальнейшего рефодинга рекомбинантного белка.