- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
3.6 Функции ngf в организме.
3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
Фактор роста нервов вызывает дифференцировку нервных клеток, а также ускоряет рост и улучшает выживание аксонов. Причем этот рост направленный, поскольку аксоны симпатических клеток обладают хемотаксисом. Иннервация ткани симпатической системой зависит от того способна ли ткань синтезировать и выделять NGF. NGF является указателем для роста симпатических аксонов, определяющим наличие или отсутствии симпатической иннервации данной ткани [].
3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
Рост нервных клеток под воздействием NGF был исследован с биохимической точки зрения. Кохен впервые показал влияние фактора роста нервов, очищенного из змеиного яда на глюкозное окисление эмбриональных сенсорных ганглиев, культивированных в пробирке. Он отметил, что для образования нервных волокон необходима глюкоза или маноза. Глюкоза не может быть полноценно заменена другими субстратами, лишь лактат и пируват могут её частично заменить. Было установлено, что NGF увеличивает окисление глюкозы на 20-40 %. Подобные результаты были получены и при использовании NGF, очищенного из подчелюстной железымыши. При введении фактора роста нервов в естественных условиях в организм новорожденных животных, так же происходит стимуляция окисления глюкозы. Контрольные эксперименты, проведённые Кохеном с различными нервными тканями, которые не взаимодействовали с NGF, не показали изменений в метаболизме глюкозы[].
Также фактор роста нервов принимает непосредственное участие в стимулировании липидного синтеза в эмбриональных сенсорных и симпатических ганглиев. С помощью тонкослойной хроматографии с последующей авторадиографией было установлено, что при культивировании ганглиев совместно с NGF синтез липидов увеличивается на 60-90 % по сравнению с контрольной группой без фактора роста нервов. Увеличение скорости образования липидов в NGF – стимулированных клетках может быть связано с повышением доступности NADPH2 ( кофактор, участвующий в биосинтезе жирных кислот) и с индукцией новых молекул данного фермента. Интересно отметить, что стимулирующее действие NGF на синтез липидов полностью пропадает под воздействием актиномицина-D в дозе, не подавляющей значительно скорости образования (включения в состав мембраны/формирования) липидов в контрольных ганглиях [].
Рост восприимчивых нервных клеток, вызванный взаимодействием с NGF, сопровождается быстрым увеличением синтеза белка внутри клеток. Коуэн впервые рассмотрел включение меченного C – лизина в белок эмбриональных сенсорных ганглиев in vitro. Под влиянием NGF включение C–лизина увеличивается на 58-72% в двадцати часовой период. Более обширные исследования по влиянию NGF на синтез белка проводили с эмбриональными сенсорными и симпатическими ганглиями курицы и верхними шейными ганглиями новорожденных мышей. Анализ растворимых белков в эмбриональных сенсорных ганглиях, инкубированных в течении различных промежутков времени, в присутствии радиоактивных предшественников, показал что NGF селективно стимулирует синтез некоторых классов белков. Экспериментально установлено, что фактор роста нервов стимулирует синтез более крупных, имеющих низкий pH белков и отрицательный заряд. Стимуляция синтеза РНК, о чем свидетельствует включение радиоактивных предшественников, является одним из первых метаболических эффектов вызванных воздействием NGF на ганглии, которые культивируют in vitro, что в последствии стимулирует синтез белка [].