- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
1.2 Нейротрофины в цнс
Особенный интерес представляет нахождение популяции клеток, чувствительной к NGF, в ЦНС. Таковыми являются холинергические нейроны, которые расположены в базальной области переднего мозга и которые иннервируют несколько различных структур, в том числе гиппокамп — область ЦНС, которая, как считают, связана с процессами памяти и обучения. Если аксоны этих нейронов у взрослой крысы перерезать, то клетки погибают. Однако, если после перерезания вводить в ЦНС NGF, то клетки выживают после аксотомии. Число этих клеток, которые окрашиваются маркерами холинергических нейронов, уменьшается с возрастом, вместе со способностью крыс запоминать лабиринт и выполнять другие пространственные задачи. Если NGF вводится взрослым крысам, число клеток, которые окрашиваются, увеличивается и улучшается выполнение крысами пространственных задач. Эти наблюдения показывают, что выживание и рост нейронов в ЦНС, скорее всего, зависит от факторов, которые одинаковы или близки к тем, которые были идентифицированы для периферических нейронов. Полученные результаты позволяют предполагать, в терминах молекулярной биологии, возможные дефекты этих факторов, которые могут привести к нарушениям развития мозга, и возможные пути борьбы с этими дефектами.
ВDNF и NT-3 широко распространены в ЦНС как во время развития, так и у взрослых. Клетки коры и гиппокампа, скорее всего, нуждаются в МНФ и NT-3 для выживания, хотя изменения в выживаемости клеток в ЦНС трудно проследить. МНФ, как было показано, влияет на рост и сложность ветвления аксонов и дендритов в развивающейся ЦНС. Анализ мышей с генетическим дефицитом представляет многообещающий подход к пониманию роли нейротрофинов в развивающейся нервной системе .
Нейротрофины также могут играть определенную роль и в ЦНС взрослых животных. Физиологическая активность вызывает экспрессию определенных нейротрофинов в разных областях ЦНС и в ответ на различные стимулы. В свою очередь, нейротрофины, как было показано, способны влиять на физиологическую активность, облегчая синаптическуюпередачу и увеличивая или уменьшая возбудимость нейронов посредством регуляции экспрессии ионных каналов.
2. Рецепторы нейтрофинов.
2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
Нейротрофины связываются с высокоаффиным рецептором pl40 prototrk с активностью (Кd = 10-11 М). Результаты биологических проб показывают, что эффекты нейротрофинов на выживание клеток и на рост отростков нервов обусловливаются высокоаффинными рецепторами.
Хотя высокоаффинные рецепторы к NGF обычно расположены только на нейронах, они были первоначально обнаружены в клетках карциномы толстой кишки человека, как часть продукта синтеза онкогена trk(онкогенами называют гены, которые управляют трансформацией клеток). Аналог онкогена trk, находящийся в нормальных клетках, кодирует белок с массой около 140 кДа, называемый pl40prototrk или просто Trk. Существуют по крайней мере три члена семейства про-онкогенов trk, каждый из которых является высокоаффинным рецептором для одного или нескольких нейротрофинов: TrkA — рецептор к NGF и NT-6; TrkB, по видимому, является рецептором к МНФ и NT-4/5, a TrkC является рецептором к NT-3[].
Рецепторы нейротрофинов TrkA, TrkB и TrkC имеют общую архитектуру. Общая структура рецепторов представляет собой два B–листа, упакованные друг с другом в верхней части в виде сэндвича. Каждый из листов содержит четыре нити (A, B, C, D)в одном листе и G, F, С, С| в другом. Петли AB, EFи CC| находятся на С терминальном конце домена, а BC, DEиFG на противоположном конце [].
Их внеклеточная часть состоит из цистеин –богатого кластера(1 домен), трёх лейцин – богатых повторов (2 домен), второго цистеин –богатого кластера (3 домен) и и двух иммуноглобулинподобных доменов (4,5 домен).Внеклеточная часть, связанна одной трансмембранной спиралью с внутриклеточным тиразинкиназным доменом. Гомологичностькиназных областей составляет более 75%, в то время как сходство внеклеточной части около 50%Во всех трех рецептарахнаиболее консервативным является пятый домен, содержащий 9 из 11 идентичных остатков. Кристаллические структуры этой области в TrkA, TrkB и TrkC, показывают,что этот сегмент включает в себя EF цикл, отвечающий за непосредственное образование лиганд – рецепторного комплекса[].
Рисунок 1 –Схема кристаллической структуры Trk рецепторов
Биологическое значение других областей, особенно четвертого домена, в настоящее время мало изучено. Ряд исследований свидетельствует о том, что наличие четвертого доменанеобходимо для эффективного образования и упаковки лиганд связывающего домена. Точная роль лейцин богатых повторов тоже пока остается спорной, но ученые предполагают, что они являются важным компонентом для связывания лиганда на TrkAи TrkB Вдругом исследовании, эти области обеспечивают высокое сродство связывания NT-3 TrkC,но являются не обязательным NGF в TrkA[].