- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
1.2 Программное обеспечение
Операционная система Windows 7, текстовый редактор Word Pad, Microsoft Office Word 2007, Microsoft Office Excel 2007, Microsoft Office Power Point 2007.Clone Manager, DNABuilder, Сhromas, ChemSketch, Swiss-Pdb Viewer, Ras Mol.
1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
Стаканы, цилиндры, конические колбы фирм Simax (Чехия), Schott Duran (Германия); системы для фильтрования и дегазирования растворов фирмы Millipore (США); кварцевые кюветы фирмы Carl Roth (Германия); мембраны из нитроцеллюлозы для dot-blot метода HVLP фирмы Millipore (США); шприцевые насадки для фильтрования Millex® GV, PVDF и 0.22 m и 0.1 m фирмы Millipore (США);системы для фильтрованияStericup® GP Express Plus объемом 250 мл, 500 мл фирмы Millipore (США).
Полипропиленовые пробирки емкостью 0.25, 0.6, 1.7 и 2.0 мл фирм Corning (США); наконечники для автоматических пипеток фирм Quantum Scientific Pty Ltd. (Австралия), Corning (США), Thermo Lab (США), Treff (Германия); полипропиленовые пробирки емкостью 15 и 50 мл фирмы Corning (США); полипропиленовые пробирки емкостью 50 мл фирмы Labcon (США); чашки с крышкой Петри фирм GreinerBio-One (Германия), Биомедикал (Россия); лабораторная пленка Parafilm® M (American National Can, США).
Латексные перчатки фирм Carl Roth (Германия) и Kimberly Clark Professional (США).
1.4 Штаммы e.Coli
XL1-Blue (“Stratogene”): F’::Tn10(Tetr), proA+B+, lacIQ, endA1, gyrA96, (lacZ)M15/recA1, , thi, hsdR17, (rk¯mk+ ), supE44, relA1, lac;
BL21(DE3): E. coliB, F¯, ompT, hsdSB (rB¯mB¯), gal, dcm (DE3); этот штамм, не содержащий протеиназ Lon, OmpT и Dcm метилазы обычно используется для экспрессии генов;
1.5 Среды для выращивания бактерий
YT: 8 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl;
TB: 1,2% бакто-триптона, 2,4% дрожжевого экстракта, 4% глицерина, 17 мМ KH2PO4, 72 мМ К2НРО4;
TB – 5052: На 50 мл: 20 x P, 100 мкл. 1M MgSO4, 10 мкл. 1000 x Trace,
1 мл. 50 x 5052, 100 мкл. ампициллина, 46 мл. TB (без фосфатов).
2ZY: 2% триптона, 1% дрожжевого экстракта;
ZYM-5052: 1% N-Zамин, 0.5% дрожжевого экстракта, 25 mMNa2HPO4, 25 mMKH2PO4,50 mM NH4C1, 5 mMNa2SO4, 2 mMMgSO4, 0.2 XTrace, 0.5 % глицерола, 0.05% глюкозы, 0.2 лактозы.
YT-агар: 1,5% агар на YT.
Во все среды перед использованием добавлялись соответствующие антибиотики. Рабочая концентрация ампецилина –50-125 мкг/мл.
1.6 Препараты днк
Коммерческие плазмиды pET32a (Novagen, США); pGEMEX1 (Promega, США).
Синтетические олигонуклеотиды для сборки гена NGF были синтезированы ЗАО «Евроген», Россия.
NGF1: GGAATTCCATATGTCTTCTTCTCAT
NGF2: TCACAAACGGAAAATTCACCACGATGAAAAATTGGATGAGAAGAAGACAT
NGF3: ATTTTCCGTTTGTGACAGCGTTTCTGTTTGGGTTGGCGACAAAACGACTG
NGF4: CAGAACCATCACCTCTTTGCCCTTGATGTCGGTCGCAGTCGTTTTGTCGC
NGF5: GAGGTGATGGTTCTGGGTGAAGTAAACATTAACAACTCCGTCTTCAAACA
NGF6: GATTCGGATCACGACATTTAGTTTCGAAGAAGTACTGTTTGAAGACGGAG
NGF7: GTCGTGATCCGAATCCGGTGGACTCCGGTTGCCGTGGTATCGATTCTAAA
NGF8: AAGGTATGAGTGGTGGTGCAATAGCTGTTCCAGTGTTTAGAATCGATACC
NGF9: CACCACTCATACCTTCGTGAAAGCGCTGACCATGGATGGTAAACAGGCAG
NGF10: CACGCAAGCGGTATCGATGCGGATGAAGCGCCATGCTGCCTGTTTACCAT
NGF11: GATACCGCTTGCGTGTGCGTACTGAGCCGTAAGGCCGTACGTCGCGCTTA
NGF12: CCGCTCGAGTTAAGCGCGACGTACG