2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf

Белковый раствор после рефолдинга содержал высокую концентрацию аргинина (0.8 М), что могло отрицательно сказаться на ферментативном расщеплении гибридного белка. Для снижения аргинина в образце был использован диализ. В данном случае самопроизвольное расщепление белка не так существенно, как при выделении гибридного белка, поскольку конечным продуктом очистки является NGF. Диализованный образец профильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего поставили ферментативное расщепление гибридного белка Ulp1 - гидролазай при 4°С в течение ночи. Подбор концентрации фермента приведен на рис _

20кДа

15кДа

13 кДа афакДа

А

10 кДа

Б

1 2 3 4 5

Рисунок _ - Подбор концентрации Ulp1 для гидролиза гибридного белка SumoNGF.

1. 5 ед. Ulp1- гидролазы на 1 мг белка

2. 10 ед. Ulp1 - гидролазы на 1 мг белка

3. 20 ед. Ulp1 - гидролазы на 1 мг белка

4. 40 ед. Ulp1 - гидролазы на 1 мг белка

5. Белковый маркер

А. Белок NGF, Б. Белок SUMO

Так расщепление идет во всех случаях одинаково, то с экономической точки зрения выгоднее всего использовать минимальную концентрацию фермента.

2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.

Для разделения продуктов гидролиза гибридного белка SumoNGF проводили катионобменную хроматографию. Одним из основных условий для проведения данного вида хроматографии является наличие заряда у выделяемого белка. Исходя из этого факта, необходимо выбирать такие значения pH, где белок будет максимально заряжен. Расчетная изоэлектрическая точка NGF лежит в районе 9 (pI 8,92), в то время как расчетная изоэлектрическая точка SUMO около 6 (pI 5,58).

С помощью программы________ были построены кривые титрования для белков SUMO и NGF (Рисунок _ )

А Б

Рисунок _ - Кривые титрования. А. NGF, Б. SUMO

На основании данных кривых был выбран рабочий pH 5.0, при котором NGF положительно заряжен, а SUMO имеет отрицательный заряд. Хроматографию проводили на SP – sepharose FF (1мл.) .

Рисунок _ - Катионобменная хроматография на SP – sepharose FF

1. Белок SUMO 2. Белок NGF.

При таком значении pH c колонкой связался только NGF, имеющий положительный заряд и вышел одним острым пиком (Рисунок _ ). Результаты хроматографии представлены на рисунке _

Рисунок _ - Очистка белка NGF

1. Расщепленный гибридный белок

2. NGF после очистки на SP – sepharose FF

13.4 кДа

12 кДа

1. 2

В результате катионобменной хроматографий был получен белок с частотой выше 90 % частоты в количестве 5 мг с литра клеточной суспензии. Выход не большой, но уже больше чем можно выделить из тканей человека.