- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
Образец растворенного гибридного белка, выделенный из 100 мл культуры, суспендировали в 4 мл буфера А, после чего смешивали с 800 мкл Ni2+-металлохелатной аффинной смолы, уравновешенной тем же буфером А и инкубировали в течение 1 часа при перемешивании. Смолу промывали сначала 5 мл буфера А, а потом 5 мл буфера В (буфер А с 150 мМ имидазола). Элюцию проводили 4 мл буфера С (буфер А с 500 мМ имидазола).
1.9.19 Рефолдинг белка
Растворенные тельца включения перевели в буфер 3 М Мочевины 100 мМ Tris pH 8.0 с помощью колонки PD - 10 . Полученный белковый раствор разбавили буферами представленными в таблице_ , и оставляли на 48 или 72 часа при температуре 5 oC.
Таблица _ - Буфера для проведения рефолдинга
№ |
Состав буфера |
1 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 0.5 мM 2 - Меркаптоэтанол |
2 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 1 мM 2 - Меркаптоэтанол |
3 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 1 мM цистеин |
4 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 5 мM цистеин |
5 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.8, 0.5 мM 2 - Меркаптоэтанол |
6 |
100 мМ Tris – HCI, pH 8.8, 1 мM цистеин |
7 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 8 мM цистеин, 400 мМ NaCI, 0.02% Tween -20 |
8 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 8 мM цистеин, 400 мМ NaCI, 0.02% Tween -20, 5% глицирин |
9 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 8 мM цистеин, 0.8 М аргинин |
10 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 8 мM ДТТ, 0.8 М аргинин |
11 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 6 мM CHAPS, 0.8 М аргинин, 15 мМ глютатион востановленный |
12 |
50 мМ Tris – HCI, pH 8.0, 6 мM CHAPS, 400 мМ NaCI, 8 мМ цистеин |
1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
2. Экспериментальные исследования
Фактор роста нервов является сигнальным белком, участвует в развитии нервной системы у позвоночных. Он осуществляет регуляцию и управление ростом аксонов, посредством механизмов клеточного сигналинга.
Современные знания о данном белке позволяет его использовать при коррекции и лечение заболеваний центральной нервной системы, связанных с психическими расстройствами (слабоумие, депрессия, шизофрения, аутизм, синдром Ретта, анорексии и булимии, болезни Альцгеймера). Кроме того он может участвовать в развитии сердечно – сосудистых заболеваниях (атеросклероз коронарных артерий, ожирение, сахарный диабет 2 типа). Существует доказательство того, что NGF может быть полезен в лечении кожных язв и язв роговицы.
Очевидно, что вследствие низкого содержания NGF в тканях человека, он не может быть выделен в достаточных количествах, поэтому разработка методов получения рекомбинантного человеческого NGF (rh-NGF), является актуальной проблемой современной науки и практической медицины.
Технологии с использованием рекомбинантной ДНК позволяют производить широкий спектр рекомбинантных белков человека для терапевтического применения, но попытки производства рекомбинантного NGF с использованием различных организмов пока не дали ожидаемых результатов.
В данной исследовательской работе предложен метод получения целевой последовательности рекомбинантного фактора роста нервов с помощью гибридной экспрессии с белком партнёром SUMO в клетках E. coli. Все этапы работы выполнялись в Блоке Белковой Химии Центра «Биоинженерия» РАН.