- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
6 Производственная санитария.
6.1 Установление категории лабораторного помещения.
Работа выполнялась в центре «Биоинженерии» РАН в Блоке Белковой Химии.
Помещение, где выполнялась работа, имеет площадь 52, 4м2 и объемом 131 мЗ. Исходя из того, что в помещении работали 3 человека, площадь на одного человека составляет 17, 46 м2, а объем – 32,75 мЗ, что соответствует норме (на одного работающего - не менее чем 4,5 м2 площади и 15 м3 объема помещения) [15].
6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
На рабочем месте всегда должны находиться средства необходимые для оказания первой помощи.
Все работающие должны знать и выполнять инструкцию по технике безопасности с горючими и вредными веществами
Все работы с выделением вредных паров или газов, с легковоспламеняющимися веществами и горючими жидкостями должны проводиться в вытяжном шкафу с выключенными газовыми горелками и электроприборами. Проводить эти работы при неисправной или выключенной вентиляции запрещается. Работы с концентрированными кислотами и щелочами приводят в защитных очках и перчатках, а при работе с большими количествами дополнительно применяют фартуки и халаты с кислотно- и щелочностойкой пропиткой.
Переливание кислот и щелочей из бутылей в мелкую тару необходимо производить при помощи сифона или разливного стакана. Концентрированные кислоты следует переливать только под тягой.
Разбавление концентрированной серной кислоты и расширение едких щелочей проводят в фарфоровой посуде, так как эти процессы сопровождаются выделением большого количества тепла. При приготовлении растворов серной кислоты необходимо кислоту приливать в воду маленькими струнками. Растворять щелочь следует путем прибавления к воде небольших кусочков при непрерывном перемешивании. Работы проводятся в вытяжном шкафу. Отработанные кислоты и щелочи следует собирать раздельно в специальную посуду, а после нейтрализации сливать в канализацию или в соответствие с местными условиями в другое специально отведенное для этого место.
Разлитые кислоты или щелочи необходимо засыпать песком, централизовать, затем провести уборку.
Хранение различных химических веществ должно производиться согласно их свойствам и правилам хранения горючих и взрывоопасных веществ. Концентрированные соляную, серную, азотную кислоты хранят в толстостенной стеклянной посуде емкостью не более двух литров, в вытяжном шкафу, на стеклянных или фарфоровых поддонах.
Химические реактивы следует хранить в определенном, предназначенном для каждого вещества месте, в закрытых банках, склянках (в емкостях объемом не более 5 литров) и других сосудах. На каждом сосуде должна быть отметка с полным названием вещества и его подробной характеристикой (концентрация, удельный вес, чистота и т.д.).
Химические реактивы, способные выделять газ, необходимо хранить в толстостенных, достаточно прочных сосудах. При открывании этих сосудов следует соблюдать осторожность и вынимать пробку постепенно. Сильнодействующие реактивы необходимо хранить в вытяжном шкафу, в металлическом поддоне.
6.3 Метеорологические условия.
Работы, производимые в лаборатории, следует отнести к категории 1б (работы, производимые сидя, стоя или связанные с ходьбой и сопровождающиеся некоторым физическим напряжением). Допустимые параметры микроклимата в рабочей зоне производственных помещений указаны в таблице 3 для работ 1б категории [2]
Таблица 3 – Допустимые параметры микроклимата
В холодный период года |
В теплый период года |
|||||
Температура, ˚С |
Относительная влажность, %, не более |
Скорость движения воздуха, м/с |
Температура, ˚С |
Относительная влажность, %, не более |
Скорость движения воздуха, м/с |
|
17 – 25 |
75 |
0,2, не более |
19 – 28 |
60 |
0,1 – 0,3 |
|
Микроклимат в лаборатории поддерживался с помощью отопления и вентиляции. В лаборатории осуществляется центральное отопление, которое поддерживает температуру 20-23°С и относительную влажность 40-60 %. Следовательно, метеорологические условия в лаборатории соответствуют требованиям санитарных норм.