- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
6.4 Вентиляция.
Обеспечение нормальных метеорологических условий и чистоты воздуха на рабочих местах в значительной степени зависит от правильно организованной системы вентиляции и кондиционирования воздуха. Работа вентиляционных систем должна создавать на постоянных рабочих местах метеорологические условия и чистоту воздушной среды, соответствующие санитарным нормам[19].
Во всех помещениях должна быть предусмотрена естественная вентиляция. Естественное движение воздуха происходит вследствие разности его плотностей вне и внутри помещения, а также под действием разности давления наружного воздуха с наветренной и подветренной стороны здания.
Согласно установленному гигиеническому нормативу предельное содержание клеток в воздухе 5 104 кл/м3. В связи с этим в здании предусмотрена приточно-вытяжная вентиляция. Приточная камера расположена в здании. Вытяжная вентиляция располагается на крыше. В комнате для вспомогательных рабочих на одного человека приходится 21,6 м3. Кратность воздухообмена 1. [7]
В атмосферном воздухе рабочей зоны должен быть организован периодический контроль за содержанием живых клеток на соответствие их установленному гигиеническому нормативу 5 104 кл/м3. Контроль осуществляется районной СЭС не реже одного раза в месяц.
В случае превышения норм ПДК необходимо улучшить вентиляцию помещения, произвести мойку и дезинфекцию поверхности установки и стен помещения.
В лаборатории имеется 1 вытяжной шкаф. Расчет фактической кратности воздухообмена в помещении ведется по формуле: K = L/W, [час-1], где
L – Объем подаваемого вентиляторами воздуха для вентиляции в помещении (L = 860 м3/ч, мощность вентиляционной установки по паспорту вытяжного шкафа);
W – объем помещения в (131 м3).
K = L/W = 860/131 = 6,56 час-1
что соответствует нормам (К = 6) по паспорту вытяжного шкафа. Работа со всеми вредными и летучими веществами в лаборатории ведется в вытяжном шкафу (скорость подсоса в нем 1,5 - 1,6 м/с, возможные отклонения - до 1,2 м/с, что позволяет использовать высоколетучие жидкости и вещества до второго класса опасности) [6].
6.5 Освещение.
Работа, выполняемая в лаборатории, относится к разряду III б, характеристика которого приведена в таблице 5 [8].
Таблица 4– характеристика
Наименова-ние помещения |
Характеристика зрительной зоны работы |
Наименьший размер объекта различения с фоном |
Контраст объекта различения с фоном |
Характеристика фона |
Освещённость (при общем освещении), лк |
Коэффициент естественного освещения, % |
Лаборато-рия биотехнологии |
Высокой точности |
0,3-0,5 |
Малый, средний |
Средний, тёмный |
400 |
2 |
Естественное освещение в лаборатории – боковое: через световые проемы в наружных стенах.
Искусственное освещение – общее: все производственные помещения освещаются однотипными светильниками, равномерно располагаемыми над освещаемой поверхностью и снабжённые лампами одинаковой мощности. По функциональному назначению искусственное освещение – рабочее, то есть обязательное во всех помещениях и на освещаемых территориях для обеспечения нормальной работы людей.
В качестве источников света в лаборатории используются люминесцентные лампы для общего освещения, помещённые в пылевлагозащищённые светильники. В вытяжном шкафу предусмотрены два взрывозащищенных (взрывобезопасных) светильника прямого света с лампами накаливания.
6.6 Шум.
Общий уровень шума не должен превышать 50 дБ.[]10,11]
Вероятные источники шума и вибрации – мешалки ферментеров, насосы и центрифуга. Следует позаботиться о снижении шума и вибрации на стадии разработки механизмов. Защита выбирается с учетом порога слышимости, составляющего 75 дБ с частотой 1 000 Гц. [9]