- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
Безопасность жизнедеятельности
Целью данного раздела дипломной работы является разработка мероприятий, направленных на улучшение работы и обеспечение охраны и безопасности труда в биотехнологической лаборатории.
1 Краткая характеристика выполняемой работы.
Дипломная работа посвящена наработке биомассы клеток Escherichia coli BL21(DE3), в хромосому которой встроен ген фактора роста нервов человека под контролем Т7 промотора, выделению и получению фактора роста нервов человека в чистом виде.
2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
Используемый в дипломной работе штамм-продуцент условно-патогенный. Должны выполняться общие требования, предъявляемые к микробиологическому производству. [17]
Тепло-влаговыделения на стадии ферментации незначительны, т. к. наработка биомассы происходит при периодическом процессе культивирования, аппараты работают поочередно, температуры культивирования 20 С, 25 С, 37 С. На данной стадии отсутствует выделение вредных газов и паров, а также образование пыли, однако имеет место выделение в воздух живых клеток бактерий. На стадии дезинтеграции биомассы используется ультразвуковая установка, при работе с ней необходимо соблюдать гигиенические требования при работе с источниками воздушного ультразвука промышленного назначения [5]
3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
Работа выполнялась в условиях химической лаборатории и была сопряжена с некоторыми опасностями, которые представлены в таблице 1.
Таблица 1. - Наиболее опасные места на стадиях выполнения дипломной работы.
№ п/п |
Наименование стадий производства особой опасности. |
Опасные и вредные производственные факторы. |
Возможные аварийные ситуации |
1 |
Получение плазмидной ДНК |
Бромистый этидий.
|
Отравление сильнейшим мутагеном., |
Открытое пламя горелки. |
Пожар . |
||
Вредные вещества (кислоты щелочи и пр.). |
Утечка вредных веществ. Химические ожоги, термические ожоги, отравление. |
||
Электрический ток |
Замыкание электрических цепей |
||
2 |
Культивирование |
Вещества, входящие в состав питательных сред |
Раздражающе и аллергическое действие. |
Работа с сосудами под давлением. |
Ожог водяным паром, утечка питательных сред, разрыв сосуда. |
||
Живые клетки условно – патогенных бактерий |
Раздражающе и аллергическое действие. |
||
Электрический ток |
Замыкание электрических цепей, пожар, поражение электрическим током |
||
Движущиеся элементы оборудования,. |
Механические травмы |
||
3 |
Центрифугирование клеток |
Контакт с микроорганизмами
|
Утечка в воздух клеток условно-патогенных микроорганизмов, аллергическое действие |
Электрический ток.
|
Замыкание электрических цепей, пожар, поражение электрическим током. |
||
4 |
Дезинтеграция клеток |
Работа с ультразвуком. |
Повышение температуры тела, замедление рефлекторных реакции на внешние раздражения, головную боль, головокружение, быструю утомляемость, расстройство вестибулярного аппарата, развивается невроз и гипотония. |
5 |
Выделение и очистка белка. |
Вредные вещества (кислоты щелочи и пр.).
|
Химические ожоги, поражение слизистых оболочек глаз и верхних дыхательных путей, отравление. |
Стеклянная посуда |
Порез стеклом |
Выполнение дипломной работы сопряжено с пятью стадиями получения рекомбинантного белка. На каждой стадии исполнитель подвергается воздействию вредных и опасных производственных факторов. Наиболее опасным является воздействие бромистого этидия на организм человека, так как он является сильнейшим мутагеном. Также большую опасность представляет контакт с живыми клетками условно – патогенных микроорганизмов и вредными веществами. В связи с этим следует использовать индивидуальные средства защиты, такие как бахилы, халат, колпак и перчатки. Следует четко разделять чистые и грязные рабочие зоны.