2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf

В подтверждения того, что полученный нами белок действительно является гибридным белком SumoNGF, вырезанные полосы из геля передали на масс-спектрометрический анализ на приборе Ultraflex Tof/Tof (Bruker Daltonik). Белковые полосы подвергались трипсинолизу, после чего масс-спектр положительно заряженных ионов снимался в отражательном режиме с использованием 2,5-дигидроксибензойной кислоты в качестве матрицы. Количество выявленных при помощи масс-спектрометра пептидных фрагментов, соответствующих последовательности SumoNGF (sequence coverage 36.7%), позволяет утверждать, что полученный нами белок действительно является гибридным белком SumoNGF (Приложение _ )

2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf

Известно, что ренатурация in vitro протекает по пути, в основном повторяющему природный, но в искусственной среде путь может разветвляться, приводя в итоге к неправильному сворачиванию полипептидных цепей. Правильное протекание процесса зависит от условий среды, которые не должны препятствовать реализации нативной структуры белка. Температура, состав, рН среды, условия проведения, концентрация белка и денатурирующего агента оказывает существенное влияние на рефолдинг белка []. Оптимальные условия проведения ренатурации не поддаются строгой систематизации и являются уникальными для каждого конкретного белка.

Подбор условий проведения рефолдинга для исследуемого гибридного белка осуществляли согласно литературным данным [ , , ]

На первом этапе данной части исследовательской работы проводили обессоливание раствора гибридного белка с помощью колонки PD - 10 Растворенные тельца включения перевели в буфер 3 М Мочевины 100 мМ Tris pH 8.0.

Далее рефолдинг проводили по схемам указанным в таблице _.

Таблица _ - Схемы проведения рефолдинга.

№ буфера	Условия рефолдинга
1	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
2	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
3	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
4	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
5	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
6	Белковый раствор разбавляли в 12 раз до концентрации белка 0.2 мг/мл и экспозиционировали 48 часов в холодильнике.
7	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике
8	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике
№ буфера	Условия рефолдинга
9	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике
10	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике
11	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике
12	Белковый раствор разбавляли в 10 раз до концентрации белка 0.1 мг/мл и экспозиционировали 72 часов в холодильнике

По окончанию рефолдинга результаты анализировались с помощью белкового электрофореза по методу Лэммли (Рисунки _ и _ ).

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №1 №2 №3 №4 №5 №6

А

Б

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рисунок _ - Результаты рефолдинга с использованием схем № 1 – 6

А. Белковый электрофорез с 2 –меркаптоэтанолом

Б. Белковый электрофорез без 2 –меркаптоэтанола

1. Белковый маркер, 2 – 13. Результаты рефолдинга схем № 1 – 6

№7 №8 №9 №10 №11 №12 №7 №8 №9 №10 №11 №12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

А Б

Рисунок _ - Результаты рефолдинга с использованием схем № 7 – 12

А. Белковый электрофорез с 2 –меркаптоэтанолом

Б. Белковый электрофорез без 2 –меркаптоэтанола

1. Очищенный гибридный белок с помощью МХАХ

2 – 13. Результаты рефолдинга схем № 7 – 12

При использовании схем № 1 – 6 существенная часть белка SumoNGF после ренатурации находилась в виде агрегатов, а так же на вторые сутки рефолдинга на электрофорезе без 2 - меркаптоэтанола пропали полосы соответствующие димеру. Что делает нецелесообразным использовать их в дальнейшем.

Для решения данной проблемы нами были предложены схемы № 7 – 12. В результате гибридного белка в виде агрегатов стало меньше, а полосы на электрофорезе без 2 – меркаптоэтанола на 2 и 3 сутки не пропадали. Лучше всего рефолдинг прошел при использовании схемы № 10 с 0.8 мМ аргинином, где почти не наблюдалось агрегатов.

В дальнейшем данная схема рефолдинга была использована для получения белка в нативной комформации.