73.Молекулярно-цитогенетические методы диагностики: fish-диагностика, сравнительная геномная гибридизация, спектроскопический анализ хромосом или спектральное кариотипирование (sky).

На основе методов молекулярного анализа нуклеиновых кислот была разработана серия новых техник изучения интерфазных хромосом, характеризующихся высокой специфичностью и точностью - методы гибридизации in situ (FISH, CGH, SKY).

Метод FISH- флуоресцентная гибридизация in situ - включает следующие этапы:

- создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин; зонды могут быть комплементарны хромосоме или ее конкретному участку;

- щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

- гибридизация хромосомной ДНК с зондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

- обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином (и дигоксегенином; для биотина таким веществом является стрептовидин, для

дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело; к этим веществам могут быть присоединены флуоресцентные красители (родамин или флуоресцеинт изотиоцианат);

- визуализация хромосом с помощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

Метод FISH используется для выявления:

- численных хромосомных аномалий в интерфазном ядре;

- структурных аномалий;

- сложных межхромосомных перестроек;

- учета симметричных аберраций у облученных лиц;

- локализации гена.

Этот достаточно простой, точный, быстрый и экономичный метод находит все более Широкое применение в диагностике врожденных аномалий, моногенных синдромов, в том числе, в пренатальной диагностике.

SKY - спектроскопический анализ хромосом. Метод основан на использовании набора зондов и флуоресцентных красителей, имеющих сродство к определенным участкам хромосом. Каждая пара хромосом, таким образом, имеет уникальные спектральные характеристики. Используя интерферометр, аналог аппарата для измерения спектра астрономических объектов, можно определить незначительные вариации в спектральном составе хромосом, неразличимые человеческим глазом. Данные подвергаются компьютерной обработке по специальной программе, в результате чего каждая пара хромосом приобретает определенный цвет. Преимущество метода состоит в более точной идентификации гомологичных хромосом, которые имеют один и тот же цвет, и возможности выявления некоторых транслокаций, которые другими цитогенетическими методами не определяются. Метод используется в онкоцитогенетике для выявления в кариотипе опухолевых клеток даже очень незначительных по величине хромосомных аберраций.

74.Ген, свойства генетического кода, генные мутации, механизмы их образования

Ген- это функционально неделимая единица наследственного материала, участок молекулы ДНК, кодирующий первичную структуру полипептида.

Подразделяется на функциональные единицы: экзоны – смысловая часть, несущая информацию о последовательности а\к в белке. Интроны – участки некодирующие последовательности. Эти участки чередуются между собой – свойство генов эукариот – прерывистость структуры смысловой части.

Генетический код - информация о первичной структуре полипептидов (последовательности аминокислот) записана в ДНК или РНК в виде трехбуквенного кода, составленного из первых букв названий четырех азотистых оснований. Последовательность из трех азотистых оснований называется триплетом или кодоном. Соответствие кодона той или иной аминокислоте составляет сущность генетического кода.

Свойства генетического кода

1) триплетность — каждая аминокислота кодируется сочетанием трех нуклеотидов.

2) однозначность — данному кодону соответствует только одна определенная аминокислота.

З) вырожденность генетического кода — одна аминокислота может кодироваться несколькими вариантами триплетов.

4) неперекрываемость — нуклеотид в мРНК входит в состав только 1 кодона.

5) линейность — триплеты в мРНК прочитываются последовательно в направлении от 5'—конца к З'—концу.

6) универсальность — генетический код человека не отличается от кода других эукариотических организмов.

Генные (точковые) мутации – это изменения в пределах одного гена, приводящие к появлению новых аллелей.

Виды:

1) Нуклеотидные замены:

• Транзиция – замена пуринового основания на другое пуриновое или пиримидинового – на другое пиримидиновое.

• Трансверсия – замена пуринового на пиримидиновое основания.

• Миссенс-мутация – мутация с изменением смысла, может меняться кодирующий кодон и соответственно заменяется кодируемая а\к, но тк код вырожденный, то не всегда мутация приведет к изменению а\к (мутация остается не выявленной).

• Нонсенс-мутация – обрыв синтеза белка в результате вставки стоп-кодона (нонсенскодон) внутрь цепи.

2) Со сдвигом рамки считывания:

• Инсерция – вставка фрагмента от 1 до неск тыс н\к, происходит сдвиг рамки считывания, белок становится более длинный.

• Делеция – выпадение отдельного нуклеотида, мб утрата до неск тыс н\к, если делеция кратна 3м, то выпад 1 кодон и 1 а\к - - происходит смещение рамки считывания.

• Дупликация – удвоение участка гена

3) Слайсинговые мутации – нарушение процесса слайсинга – не вырежется интронный участок, что перейдет на белок.

Заболевания: болезни обмена ФКУ (ген дл плеч 12 хром), гемофилия, миодистрофия ДюшенаБеккера, с. Морфана (ген 15 хром).