75.Молекулярно-генетические методы диагностики: прямая и непрямая днк-диагностика, показания для проведения.

Основная цель- это подтверждение диагноза

Диагностика носительства актуально при Хсцепленных рецессивных заболеваниях- миодистрофию Дюшена, гемофилия, либо гетерозиготное носительство при аутосомно- рецессивных заболеваниях- спинально- мышечная атрофия первого типа

Пренетальная диагностика- на ранних сроках беременности, производится обычно, если в анамнезе уже встречались генные болезни

Предимплантационная- ЭКО- чтобы подсадить женщине только эмбрионы без мутаций

Прямая днк диагностика подразумевает непосредственное выявление мутаций в днк и определение последовательности нуклеотидов в том или ином гене

2 пути

1. Знаем, что ищем- берем ген, который нас интересует и будем изучать именно этот ген

2. Не знаем, но подозреваем, например, миодистрофию Дюшена, у которой ген огромный- будем искать неизвестные мутации- проскринируем весь ген, а потом, если ничего не получим в результате мутационного скрининга, будем нуклеотид за нуклеотидом определять последовательность генов- т е его секвенировать( определять его последовательность)

ПЦР- метод выделения днк и увеличение ее копий для лучшего анализа, многократная репликация днк ин витро.

Количество днк много- легко анализировать

Электрофорез

Получившиеся фразменты ДНК кладём в агар-агар, который заряжен электричеством, фрагменты имеют - заряд и при подключении электричества фрагменты начинают двигаться в этом геле, путь, который они проходят, зависит от их длины: если они коротенькие- проходят длинный путь и наоборот, получившийся результат сравнивают с эталоном

Длина гена- укорочена- делеция

Удлиннена- вставка произошла и тд

Таргетное( прицелное) секвенирование - если мы предполагаем заболевание

Таргетная панель- если подозреваем несколько похожих заболеваний

Видим, что генетическое заболевание, но признаки не складываются в единую картинку- исследование всего генома

Непременным условием косвенной ДНК-диагностики является наличие в семье больного ребенка или возможность исследования его ДНК (пятен крови, гистологических препаратов и др.). Установление информативности предусматривает выявление такого полиморфного сайта, который может быть использован в качестве молекулярного маркера для дискриминации как мутантного, так и нормального аллеля. При этом в случае аутосомно-рецессивных заболеваний родители будут являться гетерозиготами по данному полиморфизму, а больной - гомозиготой по одному из маркерных аллелей. Именно гетерозиготность по молекулярным полиморфизмам определяет информативность той или иной семьи высокого риска рождения ребенка с генной патологией. В зависимости от распределения маркерных аллелей на гомологичных хромосомах больного и его родителей семья может быть полностью информативной для ДНК-диагностики, частично информативной или неинформативной. Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска такое количество полиморфных сайтов одного гена, чтобы точно определить, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген, и сделать семью полностью информативной для последующей ПД. Главное преимущество косвенного метода - возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутаций в самом гене и даже при отсутствии данных о точной идентификации и клонировании самого мутантного гена. Его существенными недостатками являются невозможность диагностики при отсутствии больного ребенка (нельзя точно определить, с каким полиморфным аллелем сцеплен мутантный ген), ошибка в диагнозе в связи с возможностью кроссинговера в мейозе и переноса полиморфного сайта на здоровый аллель.