106	4. Ферменты

1 единица соответствует 16,67 нкат. Удельная каталитическая активность фермента выражается в каталах на 1 г-моль фермента.

4.3. Химическое строение ферментов

По химическому строению ферменты могут быть протеинами( .е. простыми белками) и протеидами (сложными белками). Если активность фермен- тов-протеинов зависит только от структуры самого белка, то активность фер- ментов-протеидов связана с присутствием определенных групп небелковой природы – так называемых кофакторов. В роли кофакторов могут выступать или ионы металлов или сложные органические соединения, входящие как добавочная группа небелковой природы в состав фермента-протеида. Фермент в целом получил название фермент-протеид или симплекс или холофермент; белковая часть получила название белковый компонент или ферон(носитель) или апофермент; наконец, добавочная группа получила название простетическая группа или агон (активная группа) или кофермент.

Кофакторы, как правило, термостабильны, тогда как большинство ферментов при нагревании инактивируется.

Связывание кофакторов с ферментами характеризуется разной степенью сродства.

Под простетической группой часто подразумевают добавочную группу прочно связанную, не отделяемую от белковой части. Примером может служить гемогруппа цитохрома ,Сковалентно связанная с его полипептидной группой.

Под коферментом подразумевают добавочную группу, легко отделяющуюся от апофермента, обслуживающую два или несколько ферментов и способную к самостоятельному существованию. Так, коферменты НАД и НАДФ соединены с апоферментом только в период переноса протонов и электронов от субстрата на кофермент. После этого они отщепляются и находятся в жидкостях клеток в свободном состоянии. Коферменты играют роль промежуточных переносчиков электронов и протонов(первая группа коферментов), различных химических групп (аминогрупп, метильных, ацетильных групп и др.) – вторая группа коферментов, наконец, принимают участие в реакциях синтеза, изомеризации и расщепления С-С связей(третья группа коферментов). Роль коферментов в ферментах-протеидах играют большинство витаминов и вита-

миноподобных веществ (Q, В1, В2, В5, В6, B12, Вc и др.) или соединения, построенные с участием витаминов (кофермент А, НАД, НАДФ, ФАД). К на-

стоящему времени известно свыше300 отдельных ферментов, в состав которых входят в качестве коферментов витамины и их производные. Поэтому при гиповитаминозах нарушается деятельность многих ферментных систем.

4. Ферменты

107

Рассмотрим ряд коферментов. Так, кофермент А или коэнзим А (КоА или Hs-КоА) – важнейший из коферментов, переносящий ацетильные и ацильные группы, содержит в своей молекуле витамин В3 (пантотеновую кислоту).

NH2

N

N

CH3

O

O

N

N

CH2-CH2-NH CO

HS-CH2 -CH2-NH-CO

CH C CH2

O P

O

P

O

CH2

O

H

OH CH3

OH

OH

H

из-КоА

H

H

O

OH

OH

OH P

O

Коферменты никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), переносящие водородные атомы, содержат витамин В5 (никотинамид).

				+	CONH2			CONH2
	-O
		-		N		-O		+
O	P		CH2 O					N
		O		H	O P O CH2		O	-
			H
						H	H
			H	H		H		H
			OH			OH
				OH			OH
	O		NH2			O	NH2
			N		N	N		N
							N
			N	N				N
					O	P O CH2	O
O	P O CH2 O
				H		OH H	H
	OH		H			H		H
			H	H		OH	O
			OH	OH		OH P OH
							O
			НАД			НАДФ

Коферменты флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД), переносящие водородные атомы, содержат витамин В2 (рибофлавин).

108

4. Ферменты

O

NH2

O

N

N

H2C

P

OH

(CHOH)3

OH

O

O

N

N

H2C

O

P

O

P O H2C

CH

2

(CHOH)3 OH

OH

O

N

N

H C

O

CH2

3

N

N

H3C

NH

H

N

H3C

O

H

H3C

N

NH

OH HO

O

O

ФМН

ФАД

Кофермент тиаминпирофосфат (ТПФ), участвующий в переносе альдегидных групп и декарбоксилировании кетокислот, является фосфорным эфиром витамина В1 (тиамина). ТПФ в качестве кофермента входит в состав пируватдегидрогеназы, α-кетоглутаратдегидрогеназы, транскетолазы.

+

CH3

-

N

HO

CH2 N

O

CH2CH2O

P

H3C

N

NH2

O

P

OH

S

O

O

ТПФ

Кофермент тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК), переносящая одноуглеродные фрагменты при биосинтезе ряда веществ(метильные – СНз, оксиметильные – СН2ОН, формильные – О=С-Н и другие группы), является восстановленной фолиевой кислотой (витамином Вс).

	OH
	N	NH
		CH2 NH	CO NH CH COOH
	NH2 N	NH	CH2
			CH2
			COOH
		ТГФК

		4. Ферменты				109
Кофермент	пиридоксальфосфат,		участвующий	в	реакциях	декарбо-
ксилирования	аминокислот	и	переаминирования		аминокислот -с			кето
кислотами, содержит витамин В6 (пиридоксин), представитель второй группы
коферментов. Кофермент Q (убихинон), переносящий				электроны в		окисли-
тельно-восстановительных реакциях, относят к числу витаминов. Витамин Н

(биотин) в виде карбоксибиотина, служит коферментом в двух типах ферментативных реакций: в АТФ-зависимом карбоксилировании и транскарбоксилировании. Наконец, кобамидный кофермент 5’-дезоксиаденозилкобаламин, участвующий в переносе атомов водорода и одноуглеродных фрагментов, содержит в своей молекуле витамин В12 (цианкобаламин).

C

O

O

CH3

H

O

HO

CH2O

P

OH

H C

O

(CH2-CH=C

-CH2)n-H

H3C

3

N

OH

H3C

O

CH3

O

Пиридоксальфосфат.

Кофермент Q (убихинон).

O

H2N HC

COOH

CH2

- OOC N

C

CH2

NH

HC

HC

COOH

CO HN

CH

CO HN

CH2

COOH

H C

CH (CH2)4

CH2

2

S

SH

биотин

HS-глутатион

Наряду с витаминами, функцию коферментов выполняют некоторые пептиды, например, НS-глутатион (γ-глутаминилцистеинилглицин), принимающий участие в окислительно-восстановительных процессах в клетках, а также многочисленная группа нуклеотидов и их производных(аденозиновые, гуанозиновые, уридиновые, цитидиновые нуклеотиды). В частности, аденозинтрифосфат (АТФ) является переносчиком остатков фосфата и адениловой кислоты, 3’-фосфоаденозин-5’-фосфосульфат (ФАФС) – переносчиком сульфатных групп, S-аденозилметионин-переносчиком метильных групп, уридиндифосфат (УДФ) – переносчиком гликозидных остатков и уроновых кислот в виде УДФГ и УДФГК, цитидиндифосфат (ЦДФ) – переносчиком фосфохолина (в виде ЦДФХ).

110	4. Ферменты

Транспортные РНК являются коферментом аминоацил-т-РНК-синтетазы – фермента, активирующего и переносящего аминокислоты в процессе биосинтеза белка. Наконец, коферментами могут служить фосфорные эфиры некоторых моносахаридов (глюкозо-1,6-дифосфат; 2,3-дифосфоглицерат), липоевая кислота, металлопорфирины (гем), и ряд других веществ, а также ионы металлов.

В случае, если в качестве кофактора выступают ионы металлов, они выполняют функцию мостика, связывающего фермент с субстратом в результате образования координационного комплекса, или непосредственно выполняют каталитическую функцию.

Характерной особенностью ферментов-протеидов является , точто ни белковая часть (т.е. апофермент), ни добавочная группа (кофермент) по отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет выраженные ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность добавочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная группа, в свою очередь, стабилизирует белковую часть и делает ее более стойкой к денатурирующим воздействиям. Непосредственным исполнителем каталитической функции ферментов-протеидов является добавочная группа(кофермент, простетическая группа, ионы металлов), выступая в роли активного центра фер-

мента , но ее действие невозможно без участия полипептидных фрагментов белковой части фермента, которая определяет специфичность реакции на этапе фиксации субстрата. Другая особенность ферментов-протеидов состоит в том, что один и тот же кофермент, присоединяясь к различным белкам, может катализировать совершенно различные процессы. Так, пиридоксальфосфат в одном случае ускоряет трансаминирование, а в другом – декарбоксилирование аминокислот. Различный характер реакций связан с разницей в природе соответствующих апоферментов.

Иначе обстоит дело у ферментов-протеинов, не имеющих добавочной группы, которая могла бы входить в непосредственный контакт с субстратом (т.е. преобразуемым соединением). Считают, что эту функцию выполняет часть белковой молекулы, получившая название активного (каталитического) центра. Предполагается, что активный центр фермента-протеина представляет собой уникальное сочетание определенных аминокислотных остатков, входящих в состав полипептидной цепи фермента. В составе активных центров обычно встречаются остатки:

1)серина,

2)тирозина,

3)цистеина,

4)триптофана,

5)аргинина,

4. Ферменты

111

6)лизина,

7)гистидина,

8)глутаминовой кислоты,

9)аспарагиновой кислоты.

Радикалы этих аминокислот(ОН-, SН-, СООН-, NН2-группы, индольная группа, имидазольная группа, гуанидиновая группа) выполняют здесь ту же функцию, что и кофермент в составе фермента-протеида.

Аминокислотные остатки, образующие активный центр фермента-протеи- на, расположены в различных точках единой полипептидной цепи. Поэтому активный центр формируется в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру, что приводит к пространственному совмещению функциональных группнеобходимых для катализа, в активном центре.

Изменение третичной структуры белка-фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации активного центра и к изменению каталитической активности.

Кроме активного центра, у ферментов различают еще два: субстратный

и аллостерический центры.

Под субстратным центром понимают участок молекулы фермента, ответственный за присоединение вещества, подвергающегося ферментативному превращению (т.е. субстрата). Его можно сравнить о якорем, на который становится корабль-субстрат, поэтому его часто называют «якорной площадкой».

Установлено, что прикрепление субстрата к субстратному центру идет за счет взаимодействия со второй аминогруппой остатка лизина или со второй -кар боксильной группой остатка глутаминовой кислоты или с сульфгидрильной группой остатка цистеина. Это говорит о том, что природа субстратного центра у разных ферментов, по-видимому, различна. Часто субстратный и активный центры трудно разделить – это единое целое.

Аллостерический центр представляет участок молекулы фермента, пространственно отделенный от активного центра, присоединение к которому определенного низкомолекулярного вещества(лиганда, эффектора) ведет к изменению третичной структуры белковой молекулы. Последнее, в свою очередь, ведет к изменению конфигурации активного центра, сопровождающееся увеличением или уменьшением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции ферментативной активности.

Понятие об активном, субстратном и аллостерическом центре не следует абсолютизировать. В ферментах субстратный центр может совпадать(или перекрываться) с активным центром, а видоизменение третичной структуры белковой молекулы фермента может возникнуть не только при воздействии на ал-

112	4. Ферменты

лостерический центр, но и в момент присоединения субстрата к субстратному центру. Согласно гипотезе Кошланда индуцирующего соответствия фермента субстрату субстрат меняет конформацию активного центра фермента таким образом, чтобы обеспечить наилучшую адаптацию активного центра к -суб страту.

Размеры молекул ферментов различны. Молекулярные массы ферментов колеблются от нескольких тысяч до миллионов. Многие ферменты представлены белками высокой молекулярной массы, построенными из субъединиц и называемыми мультиэнзимами.

Так, например, фермент уреаза, имеющая М=480 тыс. составлена из 8 субъединиц с молекулярной массой в 60 тыс. каждая. Полная молекула глутаматдегидрогеназы (М=1 млн.), построена из четырех фрагментов(М=250 тыс.), каждый из которых образован в свою очередь шестью субъединицами с М=42 тыс. Способы соединения протомеров в мультимеры(мультиэнзимы) разнообразны.

Построенный из субъединиц фермент проявляет максимальную каталитическую активность именно в виде мультимера: диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента, а в ряде случаев изменяет его специфичность.

Полагают, что здесь осуществляется своеобразный тип аллостерической регуляции, при которой одна субъединица выступает как аллостерический регулятор каталитической активности другой субъединицы. Высказано также мнение, что ферментативная деятельность субъединиц синхронизирована со сдвигом по фазе. В результате энергетически невыгодная стадия реакции на одной субъединице оказывается сопряженной со стадией, связанной с выделением энергии на другой. Это повышает эффективность ферментативного процесса в целом.

Молекулы ферментов-мультимеров составлены, как правило, из субъединиц (протомеров) двух типов и образуют изомеры. Возникновение изоэнзимов обусловлено генетическим контролем первичной структуры белка.

В качестве примера можно привести хорошо изученные изомеры фермента лактатдегидрогеназы, катализирующей превращение молочной кислоты в пировиноградную и обратно. Молекула лактатдегидрогеназы (М=140 тыс.) составлена из 4 субъединиц (М=35 тыс.), среди которых различают два типа (Н и М), кодируемых двумя различными генами. Следовательно, фермент лактатдегидрогеназа имеет пять изомеров. Один из них, преобладающий в сердце (где преобладает аэробный распад глюкозы), составлен из четырех идентичных Н-субъединиц (Н-полипептидных цепей) и его обозначают НННН (или ЛДГ1). Другой, преобладающий в печени (в ткани которой преобладает анаэробный гликолиз) содержит четыре идентичные М-субъединицы(М-полипептидные цепи) и его обозначают ММММ (или ЛДГ5). Остальные три изофермента лак-

4. Ферменты

113

татдегидрогеназы представляют собой три различных сочетания- и Н

М-субъединиц, а именно: МММН (или ЛДГ ), ММНН (или ЛДГз), МННН

4

(или ЛДГ2). Все они отличаются друг от друга по степени активности, некоторым физико-химическим свойствам(молекулярной массе, электрофоретической подвижности, изоэлектрической точке и др.), по некоторому аминокислотному составу и аминокислотной последовательности, локализации в органах и тканях и др.

Вбиохимических исследованиях широко используют определение -изо

ферментов ЛДГ путем электрофореза. ЛДГ1 имеет выраженный отрицательный заряд и имеет наибольшую электрофоретическую подвижность. ЛДГ5 имеет наименьшую электрофоретическую подвижность.

Изоферменты описаны и для большого числа других ферментов: гексокиназы, щелочной фосфатазы, альдолазы, пируваткиназы и др.

Взависимости от возраста, физиологического состояния и др. причин в организме устанавливается то или иное соотношение изоферментов, которому соответствует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение соотношения изоферментов в организме или в отдельных тканях выступает, таким образом, как один из способов регуляции активности ферментов .

Определение изоферментов приобрело большое диагностическое значение в медицинской практике благодаря их различной локализации в тканях и органах (например, при диагностике инфаркта миокарда).

Вклетках организма ферменты функционируют обычно в составе мультимерных систем или комплексов, катализирующих определенные последовательности биохимических реакций. При этом продукт, полученный при участии первого фермента, оказывается в роли субстрата для следующего фермента и т.д.

Такие системы часто организованы в виде комплексов, состоящих из нескольких ферментов. Так, дегидрогеназа пировиноградной кислоты– мультиэнзимный комплекс (М=4 млн. 500 тыс.), состоящий из трех белков-ферментов (пируватдекарбоксилазы, липоилредуктазыацетилтрансферазы, дигидролипоилдегидрогеназы), соединенных с различными коферментами: тиаминпирофосфатом, коэнзимом А, ФАД, НАД и липоевой кислотой.

Мультиэнзимные комплексы могут быть связаны с мембранами или клеточными органеллами. Хорошим примером такой мультиферментной системы является цепь дыхательных ферментов, осуществляющих перенос электронов

ссубстрата на кислород. Отдельные ферменты этой цепи находятся на внутренней мембране митохондрий и представляют по существу часть ее структуры.

Вообще следует подчеркнуть, что в клеточном содержимом ферменты распределены не хаотически, а строго упорядоченно. В соответствии с приуроченностью биохимических процессов к органоидам клетки в последних ло-