60

2. Химия нуклеиновых кислот

2.1. Общая характеристика

Нуклеиновые кислоты были открыты в прошлом столетии Мишером в ядрах гнойных клеток. Интенсивное изучение этих соединений началось лишь последние 50 лет. Большой вклад в выяснении состава, строения и роли нуклеиновых кислот внесли исследования Левина, Чаграффа, Дэвидсона, Уотсона, Крика, Уилкиса, а также советских ученых А.Н. Белозерского, А.А. Баева, А.С. Спирина и др.

Нуклеиновые кислоты и мононуклеотиды, из которых они построены, участвуют в молекулярных механизмах хранения и передачи генетической информации. Кроме того, мононуклеотиды играют важную роль в реакциях обмена веществ и энергии, выполняя коферментные функции и функции макроэргических соединений. В последнее время появились указания на медиаторную функцию АТФ.

Нуклеиновые кислоты– высокомолекулярные соединения, с молекулярной массой до нескольких миллионов дальтон и выше. Они обладают сильно выраженными кислотными свойствами и при физиологическом значении рН несут высокий отрицательный заряд. Нуклеиновые кислоты содержат около 15% азота и 10% фосфора. В состав ДНК постоянно входят элементы С, Н, N, О, Р, а по данным последних лет– селен, который, как полагают, изоморфен фосфору.

Молекула нуклеиновой кислоты является полинуклеотидом, состоящим из очень большого количества мононуклеотидов. Мононуклеотиды, в свою очередь, при гидролизе расщепляются на азотистые основания (пуриновые или пиримидиновые), углевод – пентозу (рибозу или дезоксирибозу) и фосфорную кислоту.

Наиболее важными из входящих в состав нуклеотидов(а значит, и нуклеиновых кислот) пуриновых оснований являются аденин и гуанин(производные бициклического гетероцикла – пурина).

Кроме того, в составе нуклеиновых кислот найдено большое число так называемых минорных пуриновых оснований– метилированных производных аденина и гуанина.

NH2

N N

N N

N NH

N NH

пурин

аденин (6-аминопурин)

2. Химия нуклеиновых кислот			61
OH		O
N	N	HN	N
N	NH	N NH
NH2		NH2
енольнаяформа		кетоформа
(лактимная)		(лактамная)
		гуанин

Помимо пуриновых оснований, при гидролизе мононуклеотидов могут освобождаться пиримидиновые основания: урацил, тимин, цитозин, а иногда также 5-метилцитозин и 5-оксиметилцитозин и др. минорные производные пиримидина.

OH

O

N

N

HN

N

HO

N

O

NH

пиримидин

енольная форма

кетоформа

(лактимная)

(лактамная)

урацил

OH

O

NH2

CH3

CH3

NH2

N

NH

N

N

OH N

O

NH

OH

N

O

NH

енольнаяформа

кетоформа

енольнаяформа

кетоформа

(лактимная)

(лактамная)

(лактимная)

(лактамная)

тимин (5-метилурацил)

цитозин

N

NH2

CH3

N

NH2

CH2OH

OH

N

OH

N

5-метилцитозин

5-гидроксиметилцитозин

Наряду с азотистыми основаниями в мононуклеотидах находятся углеводы (рибозы или 2’-дезоксирибоза), которые в составе нуклеиновых кислот представлены в виде β,Д -рибофуранозной формы.

62

2. Химия нуклеиновых кислот

5'

5'

CH2OH

OH

CH2OH

OH

O

H

1'

O

4'

H

1'

H

H

3'

2'

4'

H

H

3'

2'

HO

H

H

OH

HO

H

β,Д-рибоза β,

Д-2’-дезоксирибоза

Пуриновые или пиримидиновые основания, рибоза или дезоксирибоза и фосфорная кислота связаны в молекулах нуклеотидов совершенно однотипно.

Пентозы своим 1-м углеродным атомам всегда соединяются с соответствующим основанием: с пуриновым основанием – по его 9-му атому азота, с пиримидиновым – по 1-му атому азота. Пентозы соединены с основаниями через β-гликозидные связи.

Пентоза с фосфорной кислотой соединена эфирной связью. В случае наличия в нуклеотиде дезоксирибозы сложноэфирная связь образуется с -фос форной кислотой в 3'- и 5'- положениях, а в случае наличия рибозы может быть – 2', 3' и 5'- положениях. Следует обратить внимание на то, что нуклеотиды, встречающиеся в клетке в свободной форме, содержат фосфатную группу преимущественно в 5' положении. Известны также циклические монофосфаты аденозина (3',5' - АМФ) и гуанозина (3',5'-ГМФ).

O

NH2

NH

N

N

O

N

O

CH2OH

N

N

O

OH P O CH

2

H

O

H

OH

H

H

H

H

H

O

H

HO

OH

HO

P

OH

H

O

Уридин-3'-фосфорная кислота

Дезоксиаденозин-5'-фосфорная кислота

2. Химия нуклеиновых кислот			63
	NH2
	N	N
	N	N
O	CH2 O

H H

H H

O P O OH

OH

Аденозин-3'-5'-фосфорная кислота (циклическая адениловая кислота)

Во избежание путаницы с соответствующей нумерацией атомов в пуриновых или пиримидиновых основаниях углеродные атомы в пентозе нумеруют штрих-значком.

Нуклеотиды, содержащие рибозу, называются рибонуклеотидами, а нуклеотиды, включающие дезоксирибозу – дезоксирибонуклеотидами.

При отщеплении от нуклеотида остатка фосфорной кислоты образуется соединение, получившее название нуклеозида. Нуклеотиды можно рассматривать как фосфорные эфиры нуклеозидов. Поэтому название нуклеотидов (рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов) слагается из названия соответствующего нуклеозида и фосфорной кислоты. Так как нуклеозидфосфаты (нуклеотиды) обладают довольно сильными кислотными свойствами, то их часто называют соответствующими кислотами.

В число рибонуклеотидов, входящих в состав РНК, относят:

1.цитидинмонофосфат (ЦМФ) или цитидинмонофосфорная кислота или цитидиловая кислота;

2.уридинмонофосфат (УМФ) или уридинмонофосфорная кислота или уридиловая кислота;

3.аденозин-монофосфат (АМФ) иди аденозинмонофосфорная кислота или адениловая кислота;

4.гуанозинмонофосфат (ГМФ) или гуанозинмонофосфорная кислота или гуаниловая кислота.

Вчисло дезоксирибонуклеотидов, входящих в состав ДНК, относят:

1.дезоксицитидинмонофосфат (дЦМФ) или дезоксицитидинмонофосфорная кислота или дезоксицитидиловая кислота;

64	2. Химия нуклеиновых кислот

2.дезокситимидинмонофосфат (дТМФ) или дезокситимидинмонофосфорная кислота или дезокситимидиловая кислота;

3.дезоксиаденозинмонофосфат (дАМФ) или дезоксиаденозинмонофосфорная кислота или дезоксиадениловая кислота;

4.дезоксигуанозинмонофосфат (дГМФ) или дезоксигуанозинмонофосфорная кислота или дезоксигуаниловая кислота.

Рибонуклеотиды:

		NH2
	N		N
		N	N
CH2OH
		O
	H	H
H			H
	O	OH
OH	P	OH
	O
Аденозинмонофосфат
	(АМФ)
		O
		NH
		O
CH2OH		N
		O
	H	H
H		H
	O	OH
HO	P	OH
	O

Уридинмонофосфат (УМФ)

	O
HN		N
NH2	N	N
CH2OH	O
H		H
H		H
O		OH

OH P OH

O

Гуанозинмонофосфат (ГМФ)

NH2

	N
	O
CH2OH	N
	O
H	H
H	H
O	OH
HO P	OH
O

Цитидинмонофосфат (ЦМФ)

2. Химия нуклеиновых кислот

65

Дезоксирибонуклеотиды:

NH2
N	N
N	N
CH2OH
O
H	H
H	H
O	H
HO P OH

O

Дезоксиаденозинмонофосфат

	(дАМФ)
		O
	NH	CH3
	O	N
CH2OH
	O
H	H
H		H
O	H
HO P	OH

O

Дезокситимидинмонофосфат (дТМФ)

	O
NH		N
NH2	N	N
CH2OH
	O
H		H
H		H
O		H
HO P OH
O

Дезоксигуанозинмонофосфат

(дГМФ)
						NH2
					N
				O		N
CH2OH
				O
	H				H
H						H
					H
	O
HO P				OH

O

Дезоксицитидинмонофосфат (дЦМФ)

В организме встречаются и другие нуклеотиды, не входящие в состав нуклеиновых кислот, которые играют особую роль в процессах обмена веществ, будучи связаны с теми или иными ферментами.

Строение этих нуклеотидов характеризуется тем, что фосфорная кислота присоединена в них к пятому углеродному атому пентозы и , кроме того, в нуклеотиде нередко имеется не один, а несколько остатков фосфорной кислоты. Важнейшими представителями этой группы являются аденозинмонофос-

66	2. Химия нуклеиновых кислот

форная кислота (АМФ), аденозиндифосфорная кислота (АДФ) и аденозинтрифосфорная кислоты (АТФ). АТФ – это основной носитель химической энергии в клетке.

NH

N

N

O

O

O

N N

OH P

O

P

O

P

O

CH2

O

OH

OH

OH

H

H

H

H

OH

O

HO

P

OH

O

Аденозин-5'-трифосфорная кислота

При дефосфорилировании АТФ образуются АДФ и АМФ. Дефосфорилирование АТФ сопровождается освобождением энергии, которая используется в клетках для различных процессов синтеза и др. видов работы. В свою очередь, АДФ за счет энергии, освобождающейся при окислении органических -ве ществ, фосфорилируется с образованием АТФ. В клетках организма постоянно происходит процесс дефосфорилирования АТФ и фосфорилирования АДФ и АМФ. Подобно АМФ (адениловой кислоте) происходит фосфорилирование других нуклеозидфосфатов: гуаниловой кислоты (ГМФ – ГДФ – ГТФ), уридиловой кислоты (УМФ – УДФ – УТФ), цитидиловой кислоты (ЦМФ – ЦДФ – ЦТФ). Все эти соединения в организме играют важную роль в обмене веществ

иэнергии, в частности, в биосинтезе белков (ГТФ), липидов (ЦТФ ) и углеводов (УТФ).

Существенную роль в обмене веществ играют также и другие нуклеотиды

иих производные. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) являются переносчиками водорода в окислительновосстановительных реакциях. Коэнзим А (КоА), построенный по нуклеотидному принципу, играет ведущую роль в процессах активирования, переноса и обмена жирных кислот и др. процессах.

Циклические нуклеотиды (цАМФ и цГДФ) являются вторичными мессенджерами в процессах регуляции.

2. Химия нуклеиновых кислот

67

Нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами. Характерные для каждого вида нуклеиновых кислот мононуклеотиды, объединяясь в количестве нескольких сотен, а иногда и тысяч в единую молекулу, образуют громадные полинуклеотидные цепи.

По составу входящих в нуклеиновые кислоты углеводов различают дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), содержащую дезоксирибозу, и рибонуклеиновую кислоту (РНК), содержащую рибозу. Помимо углеводного компонента ДНК и РНК отличаются по составу оснований. ДНК содержит прежде всего аденин, гуанин, цитозин и тимин; встречаются также 5-метилцитозин (тимус) и 5-оксиметилцитозин (бактериофаги). В РНК присутствуют аденин, гуанин, цитозин и урацил. Особенно разительны различия этих двух кислот в содержании минорных пуриновых и пиримидиновых оснований(в РНК их значительно больше). Основания находятся в нуклеиновых кислотах в форме лактамов (в кетоформе).

Все мононуклеотиды расположены в молекуле нуклеиновой кислоты в строго определенном порядке, свойственном данному полинуклеотиду.

Нуклеотиды в молекуле нуклеиновых кислот связаны друг с другом фосфодиэфирной связью между третьим углеродным атомом пентозы одного мононуклеотида и пятым углеродным атомом пентозы соседнего нуклеотида. Никаких разветвлений в цепи нуклеиновых кислот не обнаружено.

	NH2
N	N
O CH2	N N
	O			O
H	H
H	H		H N		CH3
O	H		O	N		O
O P	O	CH2
			O
OH
		H	H		HN		N
		H		H	H2N	N
			H
		O
	O	P	O		CH2	O	N
		OH			H		H
					H		H
							H
					O

Отрезок ДНК

Как уже говорилось, в мононуклеотиде – структурной единице нуклеиновых кислот – имеются гликозидная связь, соединяющая основания с пентозой,

эфирная связь между пентозой и фосфорной кислотой и фосфодиэфирная связь между нуклеотидами. Все эти связи прочные, ковалентные и они создают первичную структуру нуклеиновых кислот, т.е. состав и порядок чередова-

68	2. Химия нуклеиновых кислот

ния нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи нуклеиновых кислот. В настоящее время первичная структура расшифрована почти для всех т-РНК, полинуклеотидная цепь которых содержит 75-90 нуклеотидов. Структура ДНК полностью не расшифрована. Расшифрована первичная структура лишь -от дельных фрагментов ДНК.

Кроме первичной структуры нуклеиновые кислоты имеют вторичную и третичную структуры. Вторичная структура первоначально была предложена для ДНК Уотсоном и Криком в 1953 году. В основу организации этой вторичной структуры ДНК легли установленные закономерности химического состава ДНК (так называемые правила Чаргаффа). Они гласят:

1)молярное содержание в ДНК пуринов равно содержанию пиримидинов,

аименно: содержание аденина равно содержанию тимина(А=Т ) или А:Т = 1, содержание гуанина – содержанию цитозина (Г=Т) или Г:Ц = 1, суммарное содержание аденина и гуанина равно суммарному содержанию цитозина и тимина (А+Г=Ц+Т):

Ц + Т = 1

А+ Г

2)количество аминогрупп, входящих в состав ДНК оснований аденина и цитозина, равно количеству кетогрупп имеющихся там оснований гуанина и тимина. следовательно Г+Т = А+Ц или:

Г+ Т = 1

А+ Ц

Эти данные наряду с результатами рентгеноструктурных исследований способствовали формированию представлений о вторичной структуре ДНК, как двойной правовращающей спирали. Это представление предполагает наличие в ДНК двух антипараллельных комплементарных полинуклеотидых цепей спиральной формы, закрученных друг на друга. Каждая цепь представляет собой полинуклеотид, в котором фосфодиэфирной связью соединены друг с другом мононуклеотиды. Вдоль оси отдельной цепи на каждые0,64 нм приходится один мононуклеотид. Угол между смежными мононуклеотидами в каждой цепи равен 36°. Один виток спирали состоит из10 нуклеотидов, размер витка – 3,4 нм. В цепи мононуклеотиды расположены таким образом, что азотистые основания их находятся внутри двойной спирали, а пентоза и фосфорная кислота снаружи. Две параллельные идущие цепи, обвитые вокруг общей оси, связаны друг с другом своими азотистыми основаниями вдоль всей молекулы ДНК с помощью водородных связей (аденин и тимин – двумя, а гуанин и цитозин – тремя водородными связями). Водородные связи направлены от NH2-группы аденина к кетогруппе тимина и отNH2-группы гуанина к кетогруппе цитозина, от NH2-группы цитозина к кетогруппе гуанина. Наконец, во-

2. Химия нуклеиновых кислот

69

дородные связи имеются между двумя атомами азота в положениях 1 и 3 соответственно пуриновых и пиримидиновых оснований. Это приводит к тому, что последовательность расположения азотистых оснований в какой-либо одной из двух цепей может быть любая, но последовательность расположения азотистых оснований в другой цепи будет находиться в строгой зависимости от последовательности оснований первой цепи.

Пары аденин – тимин и гуанин – цитозин характеризуются избирательностью взаимодействия, т.е. являются комплементарными (дополнительными) друг к другу. Из этого следует, что макромолекула ДНК складывается из двух комплементарных друг к другу цепей, т.е. говорит о полном отражении последовательности нуклеотидов одной цепи в последовательности другой. Цепи не только комплементарны, но и антипараллельны, т.е. имеют противоположную полярность. Это означает, что мононуклеотидная связь в данной цепи имеет направление 5'-3', а в другой– 3'-5'. Большая роль в поддержании вторичной структуры биспиральных полинуклеотидов, наряду с водородными связями, отводится гидрофобным взаимодействиям.

Большинство типов РНК в отличие от ДНК имеет одноцепочную структуру, (исключение составляет РНК некоторых микроорганизмов и вирусов), однако, спаривание оснований может наступить и в этом случае внутри полинуклеотида, образуя т.н. «шпильки». Нить РНК закручивается сама на себя, образуя водородные связи между основаниями аденин – урацил и гуанин – цитозин. Молекула РНК способна к обратимым изменениям формы, размеров, числа водородных связей в зависимости от ионной силы, рН, температуры раствора и т.д.

Помимо вторичной структуры различают также третичную структуру нуклеиновых кислот, характеризующуюся суперспирализацией с образованием сверхскрученной кольцевой структуры, структуры компактного клубка и др. Это обеспечивает экономную упаковку огромной молекулы ДНК в хромосоме: вместо 8 см длины, которую она могла бы иметь в вытянутой форме, в хромосоме человека она настолько плотно упакована, что ее длина составляет

5 нм.

При определенных условиях (температуры, величины рН и др.) происходит разрушение третичной и вторичной структуры ДНК. Это явление получило название денатурации нуклеиновых кислот. Денатурация такое же характерное явление для нуклеиновых кислот, как и для белков, и сопровождается также изменением их свойств. Денатурация полинуклеотидов может быть обратимым процессом. Исследования показали, что при совместной денатурации различных ДНК бактерий и последующей ренатурации могут возникать«гибридные» молекулы ДНК, составленные из фрагментов первоначальных молекул ДНК. Это явление получило название молекулярной гибридизации и послужило основой для постановки работ в области генной инженерии, пресле-

70	2. Химия нуклеиновых кислот

дующей цель конструировать вне организма биологически активные рекомбинантные (или «гибридные») молекулы ДНК.

Содержание ДНК в клетках организма определенного вида отличается необыкновенным постоянством, тогда как межвидовые различия в этом отношении значительны. Чаргаффом, А.Н. Белозерским и др. было установлено, что препараты ДНК, изолированные из различных организмов, характеризуются разным количественным соотношением пар азотистых оснований.

Было установлено, что нуклеотидный состав ДНК является характеристикой данного организма, данного биологического вида. Иначе говоря, ДНК имеет видовую специфичность. Академик А.Н. Белозерский и его ученики выявили, что вариабельность нуклеотидного состава ДНК очень высока у эволюционно древних таксонов и сравнительно мала у молодых, что распределение метилированных оснований различно у представителей животных, растений и бактерий. На этих свойствах нуклеиновых кислот А.Н. Белозерским были разработаны принципы геносистематики объектов растительного и животного мира. В различных клетках и тканях одного и того же организма ДНК имеет идентичный или, по крайней мере, достаточно близкий нуклеотидный состав, на него не оказывает влияние стадия развития, возраст, питание и прочие физиологические факторы или условия окружающей среды. Однако, у разных организмов относительное содержание различных оснований в ДНК колеблется в широких пределах. Показателем такого рода изменчивости служит отноше-

ние аденин+ тимин			,	получившее название коэффициента специфичности
	гуанин+ цитозин

нуклеиновых кислот. В пределах каждого типа ДНК имеется бесконечное количество возможных вариаций по степени преобладания той или иной пары оснований (А+Т и Г+Ц). Это создает возможности существования того большого разнообразия ДНК, которое встречается в органическом мире.

Нуклеотидный состав РНК различных живых существ варьирует в гораздо меньших размерах, чем нуклеотидный состав ДНК. Видовая специфичность РНК создается различной последовательностью размещения нуклеотидов в их молекулах. Количество РНК в клетке может меняться под влиянием различных факторов.

В первичной структуре ДНК и информационной РНК есть одна интересная особенность: последовательность нуклеотидных остатков в РНК полностью совпадает с последовательностью нуклеотидных остатков( заменой урацила на тимин соответственно) в определенных участках ДНК. Это обстоятельство очень важно для понимания закономерностей специфического биосинтеза белка в живой природе.