1. Химия белков

35

CO-группы больше, чем в обычной кетогруппе, аналогично усилена электроположительность NH-группы. Поэтому кислородный атом карбонильной группы пептидной связи способен конкурировать за водородный атом, который связан с атомом азота иминной группы другой пептидной связи. Этот водородный атом притягивается атомом кислорода первой пептидной связи. Таким образом, водородный атом как связующее звено образует своего рода мост между атомами кислорода и азота, так называемый водородный мостик. Расстояние между атомами кислорода и азота, связанными водородным мостиком, составляет приблизительно 0,28 нм. Энергия связи относительно мала, но все же больше, чем энергия водородных мостиков между молекулами воды. Водородные мостики могут возникать и между радикалами соответствующих аминокислотных остатков, как, например, между имидазольным радикалом гистидина и гидроксильной группой тирозина или серина разных пептидных цепей или внутри одной и той же цепи между первой и четвертой пептидными группами (межпептидные водородные связи).

Свободные карбоксильные группы и аминогруппы(концевые и в радикалах) остатков аминокислот пептидной цепи белка в физиологической области рН (т.е. при рН 7) находятся в ионизированной форме. Между ними, поэтому возникают сильные электростатические силы притяжения, которые обозначают как электровалентные или ионные связи.

Наконец, между неполярными остатками различных аминокислот действуют силы Ван дер Ваальса, вызывающие лишь слабое притяжение, когда встречающиеся группы находятся достаточно близко друг от друга. Обычно принимают, что атомы, расстояние между которыми больше 0,2 нм и меньше 0,31 нм, участвуют в полярных взаимодействиях, а атомы, расстояние между которыми больше 0,31 нм и меньше 0,41 нм, участвуют в неполярных взаимодействиях. Такие связи могут встречаться наряду с другими между метильными группами аланина, углеводородными остатками фенилаланина и триптофана.

1.4. Структура белков и их функции

Ковалентные и нековалентные связи в молекулах белков определяют конфигурацию полипептидных цепей и всей белковой молекулы в целом, или, как говорят, конформацию белков или структурную организацию белков. Выделяют четыре уровня структурной организации белка: первичную, вторичную, третичную, и четвертичную. Между структурами имеются многочисленные переходы и внутренняя связь, поэтому это деление в известном смысле произвольное.

Последовательность расположения определенного числа аминокислотных остатков в полипептидной цепи белковой молекулы называется первичной

36	1. Химия белков

структурой белка. Первичная структура белковой молекулы определяется сильными ковалентными пептидными связями, а также небольшим числом дисульфидных связей. Аминокислотная последовательность является специфической характеристикой данного белка, все его молекулы в этом отношении идентичны. К примеру, в полипептидной цепи рибонуклеазы124 аминокислотных остатка и 4 дисульфидных мостика, молекулярный вес 13200. Последовательность аминокислотных остатков в белке точно детерминирована и закреплена генетически. Следует подчеркнуть, что в настоящее время расшифрована первичная структура более2500 белков, причем, аминокислотная последовательность таких белков как инсулин, лизоцим, рибонуклеаза подтверждена путем их химического синтеза. Среди белков, построенных из больших полипептидных цепей, расшифрована первичная структура тяжелой цепи иммуноглобулина М человека (610 аминокислотных остатков), глутаматдегидрогеназы из печени быка(500 аминокислотных остатков), аспартатаминотрансферазы из сердца свиньи(412 аминокислотных остатков), ДНК-зависимой- РНК-полимеразы (5000 аминокислотных остатков). Значительные работы по изучению первичной структуры белков выполнены в СССР под руководством академика Ю.А. Овчинникова (аспартатаминотрансфераза, метгемоглобин, белок L-25, нейротоксины и др.).

Считается, что первичная структура белка определяет структуры более высокого порядка и, в частности, вторичную структуру белка. Это связано с тем, что возникновение взаимодействия между определенными участками полипептидной цепи с образованием дисульфидных мостиков, водородных, ионных и неполярных связей обусловливается именно определенной последовательностью аминокислот, содержащих те или иные функциональные группы.

Под вторичной структурой понимают пространственную регулярную конфигурацию полипептидной цепи в виде альфа-спирали или бета-струк- туры. Вторичная структура определяется упорядоченным расположением цепи

за счет образования водородных связей междуCO- и NН-группами пептидных связей данной полипептидной цепи или между цепями.

Образование таких водородных связей может обусловливать ряд конформаций (видоизменений) полипептида. Эти конформации подразделяются на два больших класса: спиральные структуры и структуры типа складчатого слоя.

Белки со структурой спирали могут быть либо глобулярными, либо фибриллярными. Структура типа складчатого слоя характерна для фибриллярных белков, которые, как правило, нерастворимы в полярных растворителях(например, фиброин шелка).

По Полингу большинство из существующих спиралей, образованных полипептидными цепями белков, относятся к альфа-типу. Альфа-спирали представляют собой винтообразно закрученную влево или вправо структуру, одна-

1. Химия белков

37

ко, правая спираль значительно более стабильна и только она характерна для природных белков. Предполагают, что пептидные цепи принимают альфаспиральную конфигурацию самопроизвольно, поскольку из всех возможных форм именно эта форма является наиболее стабильной. На один виток альфаспирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, а шаг спирали равен0,54 нм. Один аминокислотный остаток занимает по высоте спирали0,15 нм. Угол подъема спирали составляет26°. Период идентичности, т.е. длина отрезка спирали, полностью повторяющегося по ходу ее, составляет 2,7 нм и включает 18 аминокислотных остатка. Каждый атом кислорода карбонильной группы и каждый атом азота иминной группы участвуют в образовании водородной связи.

Карбонильный кислород любого данного остатка аминокислоты полипептидной цепи соединен водородной связью с иминным азотом четвертого по счету остатка аминокислоты (считая вдоль пептидной цепи назад). Это можно представить следующим образом:

O

H

N

(

C

C

N

)

C

3

R

H

O

Водородные связи между отдельными СО- и NH-группами пептидных связей почти параллельны длиной оси спирали и удерживают в упорядоченном спиральном состоянии пептидную цепь. Боковые цепи (радикалы) аминокислотных остатков выступают из альфа-спирали наружу и могут, взаимодействуя друг с другом, создавать условия, при которых происходит разрыв водородных связей и образование линейных участков. Для длинного спирального участка полипептида стабилизация может осуществляться, кроме водородных связей также дисульфидными мостиками, солеподобными связями, неполярными (гидрофобными) связями и т.д. Полностью спирализованные полипептидные цепи встречаются очень редко. Обычно для белковых молекул характерна частичная спирализация, обычно не более 70%. Например, молекула рибонуклеазы спирализована всего на 17%.

Структуры типа складчатого слоя(бета-структуры) обусловлены образованием водородных связей между полипептидными цепями, в отличие от спирали, где водородные связи имеются лишь в пределах одной и той же полипептидной цепи.

Дальнейшее усложнение структуры белка связано с пространственной упаковкой чередующихся спиральных и линейных участков полипептидной цепи в компактное тело, что получило название третичной структурой белка. Другими словами, третичная структура показывает, как полипептидная цепь,

38	1. Химия белков
свернутая целиком	или частично в	спираль, расположена в пространстве.
Это – трехмерная структура белковой		молекулы. В поддержании третичной,

также как и вторичной структуры белков, участвуют:

1)водородные связи между пептидными группами,

2)водородные связи между боковыми цепями аминокислотных остатков (радикалами),

3)ионные связи,

4)дисульфидные связи,

5)неполярные или гидрофобные связи и некоторые другие.

Третичная структура определяется автоматически аминокислотной последовательностью в полипептидной цепи и размером, формой и полярностью радикалов аминокислотных остатков. Большую роль в выяснении трехмерной пространственной структуры сыграл рентгеноструктурный анализ, с помощью которого Кендрью и Перуц расшифровали более50 молекул белка. По форме третичной структуры белки в основном можно подразделить на глобулярные и фибриллярные.

Третичная конфигурация белка имеет значение, главным образом, для глобулярных белков. Результаты рентгеноструктурного анализа глобулярных белков свидетельствуют, что полипептидные цепи этих белков свернуты очень компактно. Все или почти все полярные радикалы глобулярных белков находятся на поверхности молекулы в гидратированном состоянии, тогда как гидрофобные остатки скрыты внутри глобулы. В настоящее время третичная структура расшифрована у нескольких десятков белков(гемоглобина, миоглобина, инсулина, лизоцима, пепсина, трипсина, рибонуклеазы и др.).

Методами рентгеноструктурного анализа доказано существование ещё двух уровней структурной организации белковой молекулы, оказавшихся промежуточными между вторичной и третичной структурами. Это так называемые надвторичные структуры и структурные домены. Надвторичные структуры представляют собой агрегаты полипептидных цепей, обладающих собственной вторичной структурой и образующихся в некоторых белках в результате их термодинамической или кинетической стабильности. Домен – это компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи. Домены создаются объединением и чередованием a-спиралей и b-слоёв, между которыми открываются более рыхлые структуры.

Молекулы многих белков состоят из нескольких индивидуальных полипептидных цепей, не связанных одна с другой ковалентными связями. При этом каждая из индивидуальных цепей может иметь свою собственную -пер вичную, вторичную и третичную структуру, и иногда обозначается как субъединица белка.

1. Химия белков

39

Взаимное пространственное расположение субъединиц, связанных нековалентными связями в единой белковой молекуле, и представляющих единое образование в структурном и функциональном отношении, называется четвертичной структурой белка. Крупные молекулы белков состоят, как правило, из субьединиц со сравнительно небольшим молекулярным весом. Белковые молекулы, составленные из субъединиц, принято называть мультимерами (олигомерами), а сами субъединицы протомерами2.

Полагают, что из субъединиц состоят все или почти все белки с молекулярной массой больше 50000-100000. С этой точки зрения, детально изучено строение некоторых белков. Согласно Д. Дарнелу и И. Клотцу обнаружено 537 белков, обладающих четвертичной структурой. Среди них много ферментов (например, лактатдегидрогеназа – 4 протомера двух типов).

Наиболее полные данные получены по четвертичной структуре гемоглобина. Гемоглобин состоит из двух α,β-субъединиц, каждая из которых состоит из двух полипептидиных цепей – одной α-цепи и одной β-цепи; α-цепь составлена из 141 аминокислотного остатка, β-цепь – из 146. Четыре протомера (два типа α- и два типа β-) соединяются нековалентными связями в единую молекулу гемоглобина, располагаясь в углах почти правильного тетраэдра и образуя почти шаровидную молекулу с параметрами 5,0×5,6×6,4 нм.

Четвертичная структура белков, как полагают, объясняет существование изоферментов. Изоферментами называют ферменты, встречающиеся у одного и того же биологического вида в разных структурных формах. Так, например, если молекула белка составлена из четырех протомеров типа А и В, то возможно пять сочетаний: АААА, АААВ, ААВВ, АВВВ, ВВВВ т.е. возможно существование пяти изоферментов, отличающихся большей или меньшей каталитической активностью. Такие формы найдены для фермента лактатдегидрогеназы и некоторых других ферментов.

Установлено, что малейшее изменение третичной структуры субьединицы белка (протомеров), т.е. отдельных полипептидных цепочек, делает невозможным соединение их в молекулы мультимера, т.е. образование четвертичной структуры белка. А так как третичная структура, как уже говорилось выше, задается первичной структурой белка и зависит от ряда других факторов (рН среды, концентрации солей и т.п.), то даже незначительное изменение первичной структуры белка или стандартных условий в клетке приводит к изменению функциональной активности белков. Таким образом, именно от первичной структуры молекул различных белков зависит, в первую очередь, своеоб-

2 Протомером называют отдельную полипептидную цепь, а термин субъдиница часто используют для обозначения функционально активной части олигомерного белка, т.е. белка, состоящего из нескольких отдельных полипептидных цепей (протомеров).

40	1. Химия белков

разие их свойств. Однако высшие уровни структуры белка также имеют существенное значение для его свойств.

Значение высших уровней структурной организации белка становится особенно ясным при рассмотрении взаимосвязи между специфическими свойствами белков и их конформацией. Специфические свойства белков проявляются прежде всего в энзиматической(т.е. ферментативной) специфичности. Энзимы – это такие белки, которые в большинстве случаев катализируют превращение точно определённого вещества, точно определённые реакции. В этой реакции принимают участие боковые цепи аминокислот(радикалы), находящиеся на определённом участке большой молекулы энзима(т.н. активный центр). Для некоторых энзимов установлено, какая группа, какой участок энзиматической цепи обуславливает энзиматическое действие. Так, для действия химотрипсина, необходима боковая цепь серина, являющегося 195 аминокислотным остатком полипептидной цепи, и боковая цепь гистидина, находящегося на 57 месте полипептидной цепи. Между этими остатками указанных аминокислот нет никакой связи, но благодаря возникновению третичной структуры молекулы, они сближены до такой степени, что оба участвуют в действии энзима. Эти и подобные наблюдения свидетельствуют, что третичная структура белка является обязательным условием его специфического каталитичекого действия.

Для функции белка существенна также его четвертичная структура. В качестве примера можно сослаться на взаимосвязь дыхательной функции гемоглобина и его четвертичной структуры. Гемоглобин и оксигемоглобин различаются по своей четвертичной структуре. При превращении гемоглобина в оксигемоглобин в результате присоединения кислорода расстояние между двумя β-цепями гемоглобина уменьшатся, хотя при этом и не происходит заметного изменения третичной структуры самих β-цепей.

Считается, что белки, встречающиеся в различных видах организмов и выполняющие тождественные функции, могут отличаться друг от друга своими отдельными аминокислотами или их последовательностью, но высшая организация белков одинакова, так как они выполняют одну и ту же функцию.

Об этом свидетельствует изучение у разных видов организмов строения одних и тех же пептидных гормонов, таких как инсулин, адренокортикотропный гормон и др. Так, молекула инсулина, состоит из двух полипептидных цепей, соединённых двумя дисульфидными мостиками, перекинутыми между остатками цистеина. Цепь А состоит из 21 аминокислоты, цепь В – из 30 аминокислот, расположенных в определенной последовательности. В первичной структуре цепей А молекул инсулина различного происхождения в положении 8, 9 и 10 найдены несколько различные последовательности и состав аминокислот: в бычьем инсулине – аланин-серин-валин, в инсулине свиньи– треонин-серин- изолейцин, в инсулине овцы– аланин-глицин-валин.

1. Химия белков

41

Вадренокортикотропине свиньи и овцы различие заключается в том, что

водном месте полипептидных цепей одни и те же четыре аминокислоты стоят

вдругой последовательности, однако высшие уровни организации этого белка одинаковы.

Приведенные данные свидетельствуют о видовой специфичности белков на уровне первичной структуры белковой молекулы. При этом установлено, что чем дальше отстоят друг от друга два вида, тем больше у них число различий по аминокислотным остаткам, находящихся в определенных положениях полипептидных цепей одного и того же белка.

Строение данного белка у данного организма закреплено генетически и передается потомству по законам наследственности. В передаче наследуемых признаков, однако, временами могут наступать внезапные изменения– мутации. Мутация представляет собой не что иное, как появление некоторого изменения в аминокислотном составе определённого синтезируемого белка. Если эти мутации происходят на месте таких аминокислотных остатков, которые участвуют в формировании вторичной и третичной структуры, то это приводит к тому, что из такой измененной полипептидной цепи не может образоваться соответствующий белок, а если данный белок жизненно важен, то особь будет нежизнеспособна.

Вдругих случаях изменение аминокислотной последовательности или его состава в молекулах белков могут вызывать патологические нарушения. Полинг предложил болезни, связанные с изменением структуры того или иного вещества на молекулярном уровне называть«молекулярными болезнями». В этом отношении особенно хорошо изучено такое заболевание, как серповидноклеточная анемия, обусловленная аномальной структурой гемоглобина, Установлено что при серповидноклеточной анемии в гемоглобине глутаминовая кислота нормально расположенная в β-цепи на шестом месте, заменена на валин. Такой гемоглобин благодаря своей плохой растворимости, легко выпадает в осадок в содержимом эритроцита, деформируя его в характерную серповидную форму. Такой гемоглобин обладает меньшим сродством к кислороду, что при большом его содержании в эритроцитах служит причиной возникновения у людей анемии.

Внастоящее время описано более150 аномальных гемоглобинов, характеризующихся различными заменами аминокислот. Все эти нарушения, в том числе и серповидноклеточная анемия, передаются по наследству, поскольку их появление обусловлено изменением генетического кода, т.е. структуры отдельных фрагментов матричной ДНК в ядрах клеток.

Сегодня насчитывается более1,5 тысяч наследственных болезней, начиная от сравнительно небольших нарушений и кончая нарушениями со смертельным исходом. В основе этих заболеваний зачастую лежат генетические нарушения в синтезе тех или иных ферментных белков. Так, при хорошо изу-