277

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и передаче наследственных свойств организма

Установлено, что исходным веществом для синтеза нуклеиновых кислот являются нуклеозид-5’-трифосфаты. Из трех основных частей нуклеозид-5’- трифосфатов (азотистого основания, пентозы и фосфорной кислоты) азотистые основания (пуриновые или пиримидиновые) создаются специфическим путем.

Пути возникновения пуриновых и пиримидиновых оснований различны. Однако, существуют и некоторые черты сходства в механизме их образования. Это:

1)широкое использование глицина, аспарагина и глутамина в качестве источников азота гетероциклических колец;

2)включение в состав пуриновых и пиримидиновых циклов атомов углерода из двуокиси углерода и формиата;

3)построение пуринового основания и завершение синтеза пиримидинового основания на рибозо-5-фосфате, в результате чего конечными продуктами биосинтеза являются сразу нуклеозид-5-фосфаты, а не свободные аденин, гуанин, урацил или тимин;

4)ферментативный характер всех реакций, осуществляющихся в процессе синтеза нуклеотидов.

Рассмотрим сначала путь биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов. На первом этапе происходит биосинтез карбамил-фосфата из NH3, и СО2 при участии АТФ.

NH + CO + АТФ		карбаматкиназа				OH
3	2		NH2	CO O	P O + АДФ

OH

Далее при участии специфического фермента(аспартаткарбамилтрансферазы) карбамил переносится на аминогруппу аспарагиновой кислоты с образованием карбамиласпарагиновой кислоты и фосфорной кислоты:

OH

COOH

аспартаткарбамилтрансфераза

COOH

+ Ф

CH2

NH2

CO O P

O

+

CH2

OH

NH2

CH COOH

NH2 CO NH CH COOH

карбамилфосфат

аспарагиновая кислота

карбамил-аспарагиновая

кислота

При сближении аминной и карбоксильной групп карбамиласпарагиновой кислоты происходит взаимодействие между ними с выделением молекулы во-

278	11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и
	передаче наследственных свойств организма

ды и образованием дигидрооротовой кислоты. Реакция катализируется ферментом дигидрооротазой, относящейся к классу гидролаз.

COOH

					CH2				О
						дигидрооротаза		NH	CH2
H2N	_	_	NH	_	_	-Н	О	О	СООН
		CO			CH COOH	2			NH

дигидрооротовая

кислота

Образовавшаяся дигидрооротовая кислота окисляется при участии дегидрогеназы с флавинадениндинуклеотидом (ФАД) в качестве кофермента в оротовую кислоту:

O

дигидрооротатдегидрогеназа

O

C

C

+ ФАД

HN

CH2

HN

CH

- ФАД.Н2

O

C

CH COOH

O

C

C

COOH

NH

NH

дигидрооротовая

оротовая

кислота

кислота

Оротовая кислота вступает в реакцию5’-фосфорибозил-1’-пиро- фосфатом при участии фермента, относящегося к группе трансгликозидаз. Образуется нуклеотид оротидин-5’-фосфат и пирофосфат.

O

OH

O

O

оротидин-5'-фосфатпиро-

C

фосфарилаза

HN

CH

+

C

C

O

P O

CH2 O

O P O P OH

O

COOH

OH

H

H

OH

OH

NH

оротовая

H

H

кислота

OH

OH

5'-фосфорибозил-1'-пирофосфат

O

OH

HN

O

O

O

COOH

+ HO

O

P

O

CH2 O N

P

O

P

OH

OH

H

H

OH

OH

пирофосфат

H

H

OH

OH

оротидин-5'-фосфат

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и	279
передаче наследственных свойств организма

Далее происходит декарбоксилирование оротидин-5’-фосфата с образованием пиримидиннуклеотида уридин-5’-фосфата.

O

O

OH

HN

оротидин-5'-фосфатдекар-

HN

O

COOH

боксилаза

OH

N

O

O

P

O

CH2 O

- CO2

O

P

O

CH2 O

N

OH

H

H

OH

H

H

H

H

H

H

OH

OH

OH

OH

оротидин-5'-фосфат

уридин-5'-монофосфат

Уридин-5’-фосфат занимает центральное место в биосинтезе пиримидиннуклеотидов, так как может превращаться в другие пиримидиновые нуклеотиды, что осуществляется путем реакций восстановления, аминирования и метилирования. В результате всех этих реакций обеспечивается создание фонда свободных пиримидиннуклеозидтрифосфатов (УТФ, ЦТФ, дЦТФ, дТТФ), используемых в последующем для биосинтеза ДНК и РНК.

В отличие от пиримидиновых оснований формирование пуриновых сразу совершается на 5’-фосфорибозил-1’-пирофосфате, причем, в построение пуринового кольца путем последовательных реакций вовлекается азот дикарбоновых аминокислот, амидный азот глутамина, одноуглеродные фрагменты (СО2) и атомы азота и углерода глицина. Важным промежуточным продуктом при синтезе пуриновых нуклеозидфосфатов является инозиновая кислота, образование которой происходит в результате последовательных11-ти ферментативных реакций с использованием пяти молекул АТФ. Инозиновая кислота далее может превращаться в адениловую и гуаниловую кислоты.

Синтез адениловой кислоты протекает путем аминирования инозиновой кислоты за счет аспарагиновой кислоты при участии ГТФ. Реакция протекает в два этапа:

280

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и

передаче наследственных свойств организма

O

NH

N

OH

N

N

NH2

CH COOH

+

+ ГТФ

O

P

O

CH2 O

CH2

COOH

OH

H

H

аспарагиновая кислота

H

H

OH

OH

инозиновая кислота

COOH CH2

CH COOH

NH

N

N

OH

N

N

+ Ф +

ГДФ

O

P

O

CH2 O

OH

H

H

H

H

OH

OH

аденилянтарная кислота

NH2

N

N

COOH

OH

N

N

+ Ф + ГДФ

+

CH

O P

O

CH2 O

CH

OH

H

H

COOH

фумаровая

H

H

кислота

OH

OH

адениловая

кислота

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и	281
передаче наследственных свойств организма

Биосинтез гуаниловой кислоты также совершается в два этапа. Вначале инозиновая кислота окисляется в результате оксигеназной реакции до ксантиловой кислоты, которая затем аминируется за счет глутамина при участии АТФ, превращаясь в гуаниловую кислоту:

O

O

NH

N

NH

N

OH

N

N

O

NH

+ 1/2 O2

OH

N

O

P

O

CH

O

2

O

P

O

CH2 O

OH

H

H

OH

H

H

H

H

H

H

OH

OH

OH

OH

инозиновая кислота

ксантиловая кислота

O

NH

N

O

NH

NH2

CH

COOH

OH

N

+

+

АТФ

O

P

O

CH

CH2

2 O

OH

H

H

CH2

CO

NH2

H

H

OH

глутамин

OH

ксантиловая кислота

O

NH

N

NH2

N

O

OH

N

NH2

CH

COOH

P

O

CH2 O

CH

+

2

+

АМФ + ФФ

OH

H

H

CH2

H

H

COOH

OH

OH

глутаминовая кислота

гуаниловая кислота

Превращение адениловой и гуаниловой кислот соответственно в АТФ и ГТФ происходит в двух последовательных фосфокиназных реакциях. В частности, ГМФ вначале при участии АТФ в реакции, катализируемой нуклеозидмонофосфокиназой, превращается в ГДФ, а далее ГДФ в реакции, катализи-

282	11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и
	передаче наследственных свойств организма

руемой нуклеозиддифосфокиназой, при участии второй молекулы АТФ превращается в ГТФ.

Из пуриновых нуклеотидов, наряду с рибонуклеозидтрифосфатами, возникают также соответствующие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.

Из возникших пуриновых и пиримидиновых дезокси- и рибонуклеозидтрифосфатов могут образовываться нуклеиновые кислоты.

Большой вклад в изучение проблемы биосинтеза нуклеиновых кислот внесли Очоа и Корнберг, которым удалось осуществить ферментативный синтез РНК и ДНК из мононуклеотидов.

Был выяснен ряд закономерностей в биосинтезе нуклеиновых кислот и их роль в хранении и передаче наследственных свойств организма(т.е. их роль в передаче генетической информации).

Установлено, что генетическая программа закладывается и хранится в ДНК хромосом ядер и митохондрий клеток. Передача генетической информации осуществляется от ДНК через РНК к белку, который является главным носителем жизни. Перенос генетической информации от ДНК к ДНК(т.е. биосинтез ДНК в клетке) получил название репликация или редупликация или самоудвоение. Репликация происходит во время деления клеток и размножения вирусов, когда необходимо целиком передать информацию от одного организма к другому.

Перенос генетической информации от ДНК к РНК называется транскрипцией или переписыванием, при этом копируется информация только отдельных участков ДНК, в которых закодировано строение определенного белка.

Перенос генетической информации от РНК к белку называется трансляцией или переводом, при этом транслируется только и-РНК(м-РНК) и происходит перевод информации с нуклеотидного алфавита на аминокислотный алфавит, что приводит к синтезу определенного белка.

Синтез ДНК (репликация) характеризуется рядом особенностей.

При биосинтезе ДНК первой характерной чертой специфического -био синтеза является то, что он протекает только при участии всех четырех видов дезоксирибонуклеозид-5’-трифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ , дТТФ). Вторая особенность состоит в том, что биосинтез ДНК идет при каталитическом воздействии комплекса ферментов: ДНК-репликазной системы или реплисемы, включающей более 20 т.н. репликативных ферментов и белковых факторов, в том числе ДНК-полимеразыI, II и III, РНК-полимеразы, ДНК-лигазы, ДНК-связывающего, ДНК-закручивающего и ДНК-раскручивающего белка и др. Наконец, третьей чертой биосинтеза ДНК является необходимость для его осуществления «затравки» в виде олигорибонуклеотида и ДНК-матрицы, что обеспечивает специфический биосинтез нуклеиновых кислот со строго заданной последовательностью нуклеотидных остатков в синтезируемой молекуле

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и	283
передаче наследственных свойств организма

по механизму комплементарности азотистых оснований дочерней ДНК и ДНК-матрицы. Общая схема биосинтеза ДНК может быть представлена, согласно Корнбергу, в следующем виде:

п АТФ			д АМФ
п ГТФ			д ГМФ
п ЦТФ	ДНК-полимераза, эндонуклеаза,		д ЦМФ + 1/п ФФ
	ДНК-лигаза, белковые факторы
п ТТФ			д ТМФ
			ДНК пирофосфат

Сталь и Меселсон установили, что в организме репликация ДНК осуществляется по полуконсервативному механизму, при котором цепи родительской ДНК расходятся и на каждой из них образуются комплементарные цепи дочерней ДНК. Механизм ферментативной реакции, происходящей при биосинтезе ДНК, сводится к наращиванию полинуклеотидных фрагментов, закрепленных на одноцепочной ДНК-матрице, за счет переноса на их свободную гидроксильную группу при 3’-углеродном атоме пентозы нуклеозидмонофосфатного остатка с дезоксирибонуклеозидтрифосфата, закрепленного в соседнем положении на матричной одноцепочной ДНК в соответствии с принципом комплементарности. Перенос идет в направлении5’ à 3’ и сопровождается выделением пирофосфата, что обеспечивает синтез энергией.

Детали синтеза пока не ясны. Считается, что биосинтез ДНК начинается с раскручивания биспиральной цепи ДНК с образованием т..нрепликативных вилок, двух репликативных вилок в фиксированной точке родительской ДНК под влиянием ДНК-раскручивающего белка у прокариот или сразу множества репликативных вилок у эукариот. Инициация синтеза дочерней ДНК предварительно требует синтеза на одной из одноцепочечных цепей(т.н. ведущей цепи) необычного затравочного олигорибонуклеотида (т.н. праймера – затрав-

ки) со свободной ОН-группой		3’у -углеродного	атома рибозы. С этой
ОН-группы праймера начинается затем истинный синтез дочерней ДНК по
принципу	комплементарности	азотистых	оснований	под	влиянием

ДНК-полимеразы III в направлении 5’ à З’, обратному направлению исходной цепи ДНК. На второй цепи ДНК-матрицы(т.н. отстающей цепи) также идет синтез ДНК, но в виде фрагментов(т.н. фрагментов Оказаки) в направлении 5’ à 3’. В последующем фрагменты ДНК объединяются при участии ДНКлигаз в единую полинуклеотидную цепь. Праймер разрушается рибонуклеазой Н с последующей заменой на фрагмент ДНК с помощью ДНК-полимеразы I.

284	11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и
	передаче наследственных свойств организма

Схема синтеза ДНК (репликации)

Порядок расположения нуклеозидтрифосфатов вдоль полинуклеотидной цепи матрицы ДНК в процессе репликации определяется чередованием нуклеотидов в матрице и осуществляется ДНК-полимеразойIII. В ДНК-полиме- разе имеются специфические центры связывания для матрицы, для 3’-конца растущей полинуклеотидной цепи и для вступающего в реакцию дезоксирибо- нуклеозид-5’-трифосфата. В процессе синтеза строго соблюдается принцип комплементарности, т.е. против аденина матрицы становится тимин, против гуанина матрицы – цитозин нуклеозидтрифосфатов. Между комплементарными азотистыми основаниями матрицы и вновь синтезируемой полинуклеотидной цепи образуются водородные связи. Вновь синтезированная цепь не только комплементарна матричной цепи, но и имеет противоположную полярность, т.е. антипараллельна.

Таким образом, в результате реакции синтеза ДНК на одной биспиральной молекуле ДНК-матрицы синтезируются две биспиральные молекулы ДНК, причем как качественное, так и количественное содержание нуклеотидных остатков в матричной и вновь синтезируемой нуклеиновой кислоте совпадают.

Каждая образовавшаяся двухспиральная молекула ДНК имеет одну старую (родительскую) и одну новую (дочернюю) цепь.

При синтезе ДНК происходит прямое копирование структуры матрицы и поэтому этот процесс получил название редупликации (или репликации).

11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и	285
передаче наследственных свойств организма

Кроме синтеза ДНК на ДНК-матрице открыта система биосинтеза ДНК на РНК при посредстве фермента, названного обратной транскриптазой или ревертазой или РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Этот фермент был обнаружен в 1970 году Д. Балтимором, Г. Теминым и С. Мизутани в составе различных вирусов. Новый путь синтеза ДНК получил название обратная транскрипция.

Особенность обратной транскрипции состоит в том, что в качестве матрицы выступает РНК. В этом случае синтез ДНК на РНК протекает в два этапа. Вначале на одноцепочечной РНК-матрице с помощью фермента РНК-зависи- мой-ДНК-полимеразы (ревертазы) синтезируется одноцепочечная ДНК. В результате образуется биспиральная (т.е. двухцепочечная) РНК-ДНК-молекула, которая затем служит матрицей для синтеза ДНК. Второй этап катализируется ферментом ДНК-зависимой-ДНК-полимеразой.

Предполагают, что дополнительный механизм синтеза ДНК может быть использован для внесения в геном новой информации. Исследование обратной транскрипции, как считают ученые, может сыграть большую роль в выяснении перерождения нормальных клеток в раковые, в развитии методов генной инженерии.

В нашей стране существенный вклад в решение этой проблемы внесли исследования, выполненные под руководством академика В.А. Энгельгардта.

Синтез РНК на матричной ДНК получил название транскрипции(переписывания). В отличие от синтеза ДНК синтез РНК на матричной ДНК идет, как правило, только на отдельных участках одной из цепей ДНК. Специфичность синтеза РНК во многом определяется РНК-полимеразой, состоящей из большого числа субъединиц и наделенной механизмом узнавания начальной точки синтеза, выбора соответствующей цепи ДНК и завершения процесса синтеза. Различные РНК-полимеразы катализируют синтез всех типов РНК: информационной или матричной(и-РНК), транспортной (т-РНК) и рибосомальной (р-РНК). Транскрипция требует наличия всех четырех видов рибонуклеозидтрифоофатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ. Отрезок ДНК подвергавшийся транскрипции, получил название транскриптона (или оперона у прокариот). Транскриптон включает несколько зон, имеющих разную функцию: промотор, оператор, структурные гены, терминатор.

Биосинтез РНК начинается с зоны молекулы ДНК, получившей название промотора. Между промотором и информативной последовательностью нуклеотидных остатков ДНК располагается зона оператора. Если оператор не занят белком-репрессором, РНК-полимеразная реакция осуществляется путем транскрибирования (переписывания) вначале неинформативной зоны оператора, а затем информативной зоны гена(цистрона), в котором закодирована структура индивидуального белка или р-РНК или т-РНК. Образуются первичные транскрипты (пре-и-РНК, пре-р-РНК, пре-т-РНК). В дальнейшем проис-

286	11. Синтез нуклеиновых кислот и их роль в хранении и
	передаче наследственных свойств организма

ходит видоизменение синтезированной пре-РНК, сопровождающееся разрушением ее неинформативной части и модификацией информативной части (т.н. процессинг – созревание) путем метилирования, присоединения нуклеотидов и др.

Помимо матричного синтеза РНК известен и другой путь– неспецифический синтез РНК. В этом случае исходными соединениями служат рибонуклеозиддифосфаты. Реакция идет с выделением фосфорной кислоты и образованием фосфодиэфирного мостика от5’-го к 3’-му углеродному атому остатков рибозы. Реакция ускоряется специфическим ферментом– полинуклеотидфосфорилазой, причем без участия полинуклеотида ДНК-матрицы и не обязательного одновременного присутствия в сфере реакции всех четырех видов рибонуклеотидов (АДФ, ГДФ, УДФ и ЦДФ). Синтез РНК идет в этом случае даже из одного и того же вида или из различных видов нуклеозиддифосфатов. Реакция обратима. Биологическое значение образования в организме неспецифической РНК не ясно. Полагают, что синтетическая активность полинуклеотидфосфорилазы в клетке, вероятно, не используется и биологическая функция фермента заключается в фосфоролитическом разложении и-РНК с сохранением макроэргических связей за счет образования рибонуклеозид-5'-дифосфатов.

Изучение закономерностей биосинтеза нуклеиновых кислот привело к открытию важнейшего механизма воспроизведения специфичности структуры при их новообразовании. Этот механизм сводится к взаимодействию комплементарных пуриновых и пиримидиновых оснований матрицы и нуклеозидтрифосфатов, из которых указанный синтез осуществляется.

Таким образом, комплементарный синтез по матрице оказался ведущим механизмом воспроизведения специфичности структуры при новообразовании нуклеиновых кислот. Этот же принцип имеет огромное значение и при специфическом воспроизведении первичной структуры белковых молекул, осуществляемом с помощью нуклеиновых кислот (т.н. матричный синтез белка).

Матричный биосинтез белков является фундаментом современных представлений о механизме синтеза белков в организме. Нематричный мультиэнзимный путь синтеза полипептидов, как полагают (Ф. Липман), присущ, наряду с матричным, в основном микроорганизмам. С его помощью, в частности, могут синтезироваться некоторые антибиотики пептидной природы(грамицидин, тироцидин, микобациллин), а у высокоорганизованных организмов – синтезируются ди- и трипептиды.