299

13. Молекулярные механизмы изменчивости. Молекулярная патология

Молекулярные механизмы воспроизведения генотипа , иследовательно, фенотипа, создают молекулярную основу одного из фундаментальных свойств жизни – наследственности. Противоположное свойство – изменчивость – столь же существенно, поскольку наряду с наследственностью обеспечивает возможность естественного отбора и биологической эволюции. Молекулярную основу изменчивости организма составляют наследуемые изменения первичной структуры ДНК-мутации. Различают хромосомные мутации(изменение числа хромосом, хромосомные аберрации) и генные мутации. Сущность генных мутаций составляют нерепарированные наследуемые изменения первичной структуры ДНК, которые ведут либо к прекращению синтеза белка, кодируемого поврежденным структурным геном, либо к синтезу измененного, «неправильного» белка. Мутации в регуляторных участках транскриптона(промоторе, операторе) ведут к нарушению регуляции или прекращению синтеза белка. Существуют следующие варианты генных мутаций: 1) транзиция или замена пар оснований (нуклеотидов), 2) делеция или выпадение одной пары или групп пар оснований (нуклеотидов), 3) вставка одной или групп пар оснований (нуклеотидов), 4) изменение местоположения отдельных участков ДНК.

Мутации бывают спонтанными (они очень редки) и вызванными различными факторами (мутагенами): чужеродными и природными. К последним относят пероксидные соединения, свободные радикалы и т.д. К чужеродным мутагенам относятся химические вещества(алкилирующие соединения, окислители и т.д.), физические факторы (ионизирующее излечение) и биологические факторы (вирусы и др.). Мутации могут происходить как в соматических клетках, так и в половых. При половом размножении наследуются только мутации половых клеток. Мутации могут быть нейтральными, полезными или вредными. Если в результате мутации свойства белка изменяются таким образом, что особь получает преимущество для выживания, то мутация биологически полезна. Однако чаще всего мутации бывают вредными и могут приводить к молекулярной патологии.

Под молекулярными болезнями принято понимать заболевания, основной причиной которых является генетически обусловленное нарушение функции белков.

Молекулярная болезнь развивается вследствие образования или дефектного белка, или явно недостаточного количества нормального белка, неспособного из-за этого выполнять в полном объеме свои функции в организме. Молекулярные болезни обозначаются как протеинопатии.

300	13. Молекулярные механизмы изменчивости.
	Молекулярная патология

Протеинопатии подразделяют на две группы: ферментные (т.е. ферментопатии) и неферментные. При ферментопатиях имеет место дефект ферментных белков, что приводит к нарушению определенного звена обмена веществ. При неферментных протеинопатиях возникают дефекты неферментных белков, выполняющих различные функции– транспортную, рецепторную, сократительную, иммунологическую и т.д. Это приводит к нарушению тех процессов, которые зависят от данного неферментного белка. Возможна и смешанная протеинопатия.

Примерами ферментопатий аминокислотного обмена может служить:

1)фенилкетонурия (фенилпировиноградная олигофрения), связанная с дефектом фенилаланингидроксилазы.

2)альбинизм, связанный с дефектом тирозиназы.

3)тирозинемия, связанная с дефектом п-гидроксифенилпируватоксидазы.

4)алкаптонурия, связанная с дефектом гомогентизинатоксидазы и др.

Известны ферментопатии углеводного обмена(например, гликогенозы и галактоземия), ферментопатии липидного обмена (различные липидозы).

К числу неферментных протеинопатий относятся гемоглобинопатии, аминоацидурия (дефект транспортного белка), цистинурия (дефект транспортного белка), фруктозурия, глюкозурия и пентозурия (дефект транспортного белка).

Нарушения защитных реакций организма, связанных с недостатков антител, получили название агаммаглобулинемия.

Следует сказать, что ежегодно на земном шаре рождается около16 млн. детей с наследственными дефектами. И их число растет, что связано с неблагоприятными экологическими условиями проживания населения.

301

14.Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

Врезультате мутации у разных особей могут возникать варианты генов, обеспечивающих образование полноценных белков. Варианты генов, образующихся у отдельных особей, могут постепенно распространяться в популяции в результате наследования. Так формируется генотипическая неоднородность популяции, которая ведет и к фенотипической неоднородности. На молекулярном уровне генотипическая гетерогенность проявляется полиформизмом белков, т.е. существованием разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень близкие функции. Такие белки получили название «изобелки».

Таким образом, изобелки – это множественные молекулярные формы белка, обнаруживаемые в пределах организма одного биологического вида как результат наличия более чем одного структурного гена в генофонде вида для этого белка.

Наиболее изучен полиморфизм ферментных белков, т.е. наличие изоферментов. Известны также белки гемоглобина, α-антитрипсина, групп крови и др. В настоящее время известны десятки белков, для которых найдены множественные формы. Можно считать, что полиморфизм белков лежит в основе биохимической индивидуальности человека. Значительный интерес представляет разнообразие особой группы белков-иммуноглобулинов (или антител).

Иммуноглобулины (антитела) представляют собой белки плазмы крови, которые по своей электрофоретической подвижности относятся к -гамма глобулинам – наименее подвижной в электрическом поле фракции белков сыворотки крови. Антитела (иммуноглобулины) – это специализированные белки с характерными особенностями строения, функций, регуляции биосинтеза. С ними связан иммунитет, т.е. специфическая защита организма от генетически чужеродных молекул и клеток, в том числе от всевозможных инфекционных агентов (бактерий, вирусов, грибов, простейших) – антигенов. Следовательно, антитела – это специализированные белки, вырабатываемые в ответ на введение в организм генетически чужеродных соединений(антигенов) и обладающих способностью связываться с ними, вызывая образование осадка (реакцию преципитации) или склеивание клеток (реакцию агглютинации) или разрушение мембран клеток (реакцию лизиса). Антитела синтезируются в В-лимфоци- тах при участии Т-лимфоцитов(точнее: плазмоцитами, образуемыми В-лимфоцитами при участии макрофагов и T-хелперов).

Иммуноглобулины и синтезирующие их В-лимфоциты(плазмоциты) составляют только часть иммунной системы организма, обеспечивающей гуморальный иммунитет. Антитела образуются, главным образом, в лимфотических узлах и селезенке и, выделяясь в кровь, составляют фракцию иммуноглобулинов (или гамма-глобулинов) плазмы крови. Кроме крови, антитела обна-

302	14. Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

ружены в экскреторных жидкостях(молоке, слюне, слезах и др.), а также на поверхности некоторых типов клеток лимфатической системы.

Антитела по химической природе являются высокомолекулярными гликопротеидами. Будучи гликопротеидами, различные классы иммуноглобулинов содержат от 2-3 до 10-12% ковалентно связанных с белком гексозо- и гексозоаминсодержащих олигосахаридов с небольшим количеством сиаловой кислоты и фукозы.

По структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины разделяются на пять классов, обозначаемых как IgG, IgA, IgM, IgE, IgD. Иммуноглобулины G, A, M имеют подклассы. Все классы и подклассы иммуноглобулинов различаются по аминокислотной последовательности. Они отличаются друг от друга физико-химическими особенностями, и поэтому их можно выделить из сыворотки крови электрофорезом, изоэлектрическим осаждением спиртом и кислотами, высаливанием, аффинной хроматографией и другими физическими и химическими методами. IgG, IgA, IgM, представлены в крови количественно более существенно: соответственно у здорового человека 70-80%, 5-10% и 10-25% от общего содержания иммуноглобулинов.

Структурную основу иммуноглобулинов всех классов составляют четыре полипептидных цепи: две одинаковые тяжелые цепи(цепи Н с молекулярной массой 50000-55000) и две одинаковые легкие (цепи L с молекулярной массой 20000-25000). С помощью межцепочечных дисульфидных связей, а также нековалентных взаимодействий четыре цепи объединяются в единую ковалентно связанную структуру, обозначаемую как мономер. Мономер имеет V-образную форму. IgА и IgМ построены из 2-5 мономеров, связанных между собой j-цепями (полипептидными цепями). Соответственно каждому классу иммуноглобулинов (М, G, А, Е, Д) различают пять типов тяжелых цепей: μ (мю), g (гамма), a (альфа), έ (эпсилон) и δ (дельта), имеющих молекулярную массу в пределах50-70 кД (содержат 420-700 аминокислотных остатков) и различающихся по антигенности. Легкие цепи всех пяти классов являются общими и бывают двух типов: κ (каппа) и λ (лямбда). Они имеют молекулярную массу около 23 кД (содержат 214-219 аминокислотных остатков). L-цепи иммуноглобулинов различных классов могут вступать в соединение(рекомбинироваться) как с гомологичными, так и гетерологичными Н-цепями. Однако,

в одной и той же молекуле могут быть только идентичные L-цепи.

Как в Н-, так и в L-цепях имеются вариабельная V-область, в которой последовательность аминокислот непостоянна, и константная или постоянная С-область с постоянным набором аминокислот. В легких и тяжелых цепях различают NH2- и СООНконцевые группы. Как Н-цепи, так и L-цепи имеют отдельные, линейно связанные компактные участки, названные доменами (около 110-120 аминокислотных остатка). В Н-цепи их по 4, а в L-цепи – по 2. Вариабельные участки (области) располагаются в N-концевых частях L- и Н-цепей.

14. Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

303

В L-цепях к вариабельному участку относится около100 аминокислотных остатков, а в тяжелых цепях – около 120. В вариабельных участках цепей иммуноглобулинов выделяют гипервариабельные области. Эти области формируют участки связывания антигенов и называются антигенсвязывающими центрами молекул антител (детерминантами). В каждой молекуле иммуноглобулина (мономера) имеются две детерминанты, относящихся к гипервариабельным участкам Н- и L-цепей и, следовательно, каждая молекула иммуноглобулина может связать две молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными. Типовой структурой молекул иммуноглобулинов являетсяIgG, который имеет два центра (детерминанты) для связывания эпитопов поливалентного антигена. Остальные классы иммуноглобулинов отличаются дополнительными элементами их организации. Так, IgМ представляет собой пентамер, т.е. пять молекул IgG связанные j-цепью образуют – IgМ, имеющий десять детерминант.

Аминокислотная последовательность в активных центрах(детерминантах) иммуноглобулинов варьирует в связи с различиями в специфичности антител. Эти структурные особенности обеспечивают возможность взаимодействия с различными антигенами.

Антигенами называются все те вещества, которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. Типичными антигенами являются чужеродные белки, полисахариды микроорганизмов. Антигенные свойства могут проявлять нуклеиновые кислоты, сложные липиды, некоторые низкомолекулярные вещества (ряд гормонов, лекарств), химически синтезированные соединения. При этом низкомолекулярные вещества сами по себе не индуцируют синтез антител, но после их присоединения к молекуле белка стимулируют образование антител как к белку, так и к присоединенному низкомолекулярному веществу (такие вещества получили название гаптены). Роль антигенов могут выполнять не только свободные макромолекулы, но и молекулы, встроенные в поверхность каких-либо крупных частиц, например, молекулы поверхности бактериальной клетки. Собственные макромолекулы организма в норме не вызывают образование антител, т.е. не являются антигенами. Каждый антиген стимулирует образование антител лишь одного определенного типа. Эти антитела распознают и связывают только данный антиген или близко родственные молекулы. Подобная реакция организма, высоко специфическая по отношению к антигену, называется иммунным ответом или иммунной реакцией. Способность к иммунному ответу свойственна только позвоночным и, следовательно, возникла на относительно поздних этапах биологической эволюции.

Специфичность антител при связывании антигенов обусловлена как первичной, так и третичной структурой иммуноглобулинов. Третичная структура

304	14. Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

иммуноглобулинов комплементарна конформации антигена, обеспечивает сближение, взаимную ориентацию специфических участков полипептидной цепи с образованием связывающего участка. Однако узкая избирательность взаимодействия антител с антигенами определяется в первую очередь различиями первичной структуры вариабельных участков. Избирательность взаимодействия антиген– антитело обусловлена, в конечном итоге, комплементарностью между структурой активного центра антитела и структурой некоторого участка антигена, обозначаемого антигенной детерминантой (эпитопом). Антигенной детерминантой может служить участок поверхности белка, образованный радикалами аминокислот, гаптен или простетическая группа белка, в частности, полисахаридная группа гликопротеинов. Отдельные участки поверхности одного и того же антигена могут быть разными антигеннымиде терминантами, т.е. антигены поливаленты. В результате к каждой молекуле антигена может присоединиться несколько молекул антител, так как на антигене существует несколько антигенных детерминант, к каждой из которых присоединяется специфическая молекула антитела. С другой стороны, молекула антитела содержит два участка связывания(центра связывания – детерминанты). В итоге возникают сложные молекулярные комплексы или, как их называют, трехмерные решетки из чередующихся молекул антигена и антитела. Такие комплексы могут выпадать в осадок– происходит реакция преципитации. С помощью реакции преципитации образование антител исследуют количественно. Если антитела, взаимодействуя с антигенами, локализованными на мембране клеток, вызывают склеивание клеток, то их называют агглютининами, если же они вызывают лизис(разрушение клеточной оболочки), их называют лизинами. В лизисе клеток, наряду с антителом, участвует сложная ферментная система плазмы крови– комплемент, которая участвует в обеспечении неспецифической реакции защиты против бактерий, вирусов. В конечном итоге комплексы антитело– нтиген поглощаются фагоцитирующими клетками, и все компоненты комплекса разрушаются до мономеров. Таким об-

разом, комплемент вместе с антителами и специализированными клетками участвует в защите организма от инфекций.

В ответ на введение любого антигена могут вырабатываться антитела всех пяти классов. Информацию о специфичности синтезируемого иммуноглобулина плазмоциты, их синтезирующие, получают от В-лимфоцитов, на которых имеются рецепторы, с которыми и взаимодействуют антигены. L- и Н-цепи синтезируются на полирибосомах плазмоцита отдельно, поскольку иммуноглобулиновая молекула кодируется тремя группами генов. Одна группа кодирует Н-цепь любого класса, другая – L-цепъ каппа-типа и третья – L-цепь лям- бда-типа. Синтезированные Н- и L- цепи соединяются в единую молекулу перед выделением из клетки. Сборка молекулы иммуноглобулина из - Ни L-цепей происходит очень быстро. Каждый плазмоцит синтезирует до2000

14. Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

305

молекул в секунду. Выделение молекул иммуноглобулинов из плазмоцита осуществляется путем экзоцитоза.

Иммуноглобулины, как и всякий белок, обладает антигенностью. В молекуле иммуноглобулина различают три типа антигенных детерминант: изотипические, аллотипические и идиотипические. Изотипические детерминанты (изотипы) являются видовыми, т.е. они идентичны для всех особей данного вида. Аллотипические детерминанты (аллотипы) у одних особей данного вида имеются, у других отсутствуют, т.е. они являются индивидуальными. Наконец, идиотипические детерминанты (идиотипы) присущи только молекулам антител, обладающих определенной специфичностью. Эти детерминантные различия обусловлены числом и порядком чередования аминокислот в активном центре молекулы иммуноглобулина. Изотипические детерминанты располагаются в постоянной С-части Н- и L-цепей и служат для дифференцировки иммуноглобулинов на классы и подклассы. Аллотипические детерминанты отражают внутривидовые антигенные различия иммуноглобулинов, а идиотипические детерминанты – индивидуальные различия в строении активного центра. Следовательно, имеется огромное разнообразие иммуноглобулинов, отличающихся по типу антигенных связывающих центров. Этим определяется множественность антител и их специфичность по отношению ко всему многообразию антигенов, существующих в природе. Число вариаций активных центров антител огромно, практически беспредельно, так как оно определяется числом

Н- и L-цепей, их вариантами (аллотипами) и, особенно, идиотипическим разнообразием активных центров. Такое различие закреплено генетически и осуществляется в процессе формирования активных центров в зависимости от специфичности активного центра антигена. Благодаря постоянным мутациям генов, мутациям клонов иммунокомпетентных клеток, главным образом, лимфоцитов, практически на введение любого антигена может последовать реакция образования специфического антитела, и размножение того клона лимфоцитов, который синтезирует антитела, комплементарные антигену. Следует подчеркнуть, что одна плазматическая клетка вырабатывает антитела только одной специфичности. Следовательно, в организме должно существовать множество клонов иммунокомпетентных клеток. Таким образом, существование антител к данному антигену не является результатом действия самого антигена. В организме уже заранее имеется готовый набор антител, способных связывать огромное количество разных чужеродных веществ, с которыми организм прежде никогда не встречался. Однако до встречи с антигеном, концентрация антител к нему в организме ничтожна. Антиген, присоединяясь к лимфоцитам при условии соответствия(комплементарности) рецепторов клеток клона и антигена лишь вызывает пролиферацию этого клона и активирует синтез и секрецию антител клетками этого клона. Окончательно механизм синтеза и передачи по наследству способности вырабатывать огромное коли-

306	14. Полиморфизм белков. Иммуноглубулины

чество специфических антител буквально к любому из многочисленных антигенов неясен.

Наиболее полно этот механизм объясняет клонально– селекционная теория Ф. Барнета и теория С. Тоногавы. Развитие этих теорий привело к воззрению, что в эмбриональном периоде в предшественниках лимфоцитов кодоны генов, кодирующие разные области пептидных цепей антител, расположены не рядом друг с другом, гены имеют фрагментарную организацию, фрагменты этих генов разбросаны по хромосоме в разных частях во многих экземплярах. Они собираются в функциональный ген, контролирующий образование вариабельных доменов, случайным образом в ходе развития плазматической клетки перед началом транскрипции. Происходит особого рода рекомбинация генов, получившая название транспозиций генов. При этом число возможных комбинаций выражается в миллионах вариантов функционирующего гена.

Транспозиция является важнейшим моментом дифференцировки лимфоцитов и образования клонов, осуществляющихся в процессе онтогенеза. Рекомбинации в иммуноглобулиновых генах завершаются к тому моменту дифференциации, когда клетки впервые встречаются с антигенами. К этому моменту образуется популяция клеток с широким диапазоном специфичности. С конкретным антигеном взаимодействуют только адекватные клетки, несущие комплементарные рецепторы, которые начинают быстро пролифелировать. Затем, уже во время пролиферации отобранных клонов антитело–продуцирую- щих клеток, включается мутагенный механизм, изменяя в отдельных местах генов нуклеотидные последовательности. Соматические мутации еще более повышают число возможных типов иммуноглобулинов. Все это обеспечивает достаточность разнообразия специфичности антител ко всем возможным антигенам. Следует сказать, что изучение молекулярных основ строения и функционирования иммуноглобулинов находится в начальной стадии.