369

17. Фармацевтическая биохимия

17.1. Общая характеристика

Развитие фармации тесно связано с познанием фундаментальных биохимических процессов в организме и разработкой биохимических методов изучения его жизнедеятельности и реакций на воздействие лекарственных средств.

Фармация активно использует достижения, методологию и методы современной биохимии.

Биохимические исследования используются при решении таких вопросов технологии лекарств как биологическое обоснование эффективности различных лекарственных форм лечебного средства или комбинации средств, их эффективности действия; таких вопросов фармацевтической химии как разработка биохимических методов стандартизации и контроля качества лекарств, анализа производства лекарственных веществ; таких вопросов фармакологии и токсикологической химии как поиск новых лекарственных средств, оценка эффективности и токсичности лекарств и ядов, изучение механизма их дейст-

вия на основе исследования их превращения и влияния на биохимические процессы в организме.

Вся эта совокупность биохимических знаний, необходимых для решения фармацевтических задач, объединяется специальной областью биохимии– фармацевтической биохимией.

Биохимические исследования широко используются государственной системой контроля качества лекарств для оценки специфической активности, побочного действия и клинической эффективности аутобиогенных лекарств, относящихся к группе природных биорегуляторов(гормоны, гормоноиды, витамины, ферменты, биогенные амины и т.д.). Биологические и биохимические методы используются, если физико-химические анализы оказываются недостаточно точными. Для ряда препаратов, например, белково-пептидных гормонов, ферментов, приемлема только биологическая стандартизация, поскольку содержание этих белков в образцах препаратов, определенное любыми химическими методами анализа, не позволяет оценить их биологическую активность. Это объясняется тем, что активны только нативные белки, а при выделении, приготовлении лекарственных препаратов, при их длительном хранении нативность может быть утрачена, что приводит к потере биологической активности при том же содержании белка.

В этой связи стандартизация, к примеру, инсулина, проводится по снижению им содержания глюкозы в крови, кальцитонина – по снижению содержания кальция в крови, паратгормона – по повышению кальция в крови, корти-

370 17. Фармацевтическая биохимия

котропина – по снижению количества аскорбиновой кислоты и холестерина в надпочечниках и т.д.

Методы эти длительны и сложны. Так, определение активности инсулина проводят на кроликах, которых предварительно в течение двух недель выдерживают на специальной сбалансированной диете, затем дважды, с интервалом в 7-8 дней, проводят пробу на чувствительность к инсулину: после 18-часового голодания вводят препарат подкожно(0,4 ЕД/кг) и определяют сахар в крови через 1 и 2,5 часа. Из дальнейших опытов исключаются животные с исходной концентрацией сахара в крови ниже75 мг% и выше 120 мг%, а также реагирующие на указанную дозу инсулина судорогами или дающие снижение концентрации сахара менее чем на15%. Оставшихся животных методом случайного выбора разбивают на две группы (не менее 9) и не ранее, чем через 8 дней после испытания на чувствительность, проводят определение биологической активности. Для этого вводят под кожу по 0,5 ЕД/кг инсулина: одной группе животных стандартный препарат, другой – испытуемый, затем определяют сахар в крови. Через 5 дней проводят повторные испытания, но уже первой группе вводят испытуемый препарат, а второй – стандартный. Рассчитывают среднюю величину снижения сахара на стандартный(% S) и испытуемый (%

Т) препараты, определяют коэффициент	R =	% S	и рассчитывают активность
		% T

испытуемого препарата. Определение проводят не менее двух разc каждым испытуемым образцом. Таким образом, на определение биологической активности инсулина уходит не менее месяца.

Последние достижения в области энзимологии, развитие методов иммуноферментного и радиоиммунологического анализов позволили существенно усовершенствовать биохимические методы стандартизации и контроля качества лекарственных веществ. Для определения в крови и моче ряда природных лекарственных веществ (например, гормонов) и лекарств– чужеродных веществ (кодеина, морфина, барбитуратов и др) стали, к примеру, с успехом использовать иммуноферментный и радиоиммунологический методы, основанные на анализе взаимодействия антиген-антитело. Оба метода обеспечивают высокую специфичность и чувствительность анализа.

Развитие прикладных областей биохимии, молекулярной биологии и биологии клетки, молекулярной генетики, существенно изменило способы получения целого ряда лекарственных препаратов, обеспечило бурное развитие фармацевтической биотехнологии. В фармацевтической биотехнологии достигнуты ощутимые успехи в области микробного синтеза лекарственных - ве ществ, получения и применения ферментов для медицинских целей и в фармацевтической промышленности, в области генно-инженерной биотехнологии лекарственных средств.

17. Фармацевтическая биохимия

371

Внастоящее время широкое применение для лечения и профилактики различных заболеваний находят препараты ферментов и их ингибиторов. Внедрение энзимотерапии в медицинскую практику обеспечили успехи в разработке совершенных методов препаративного выделения высокоочищенных препаратов ферментов и их ингибиторов, пригодных для медицинских целей. Ферментные препараты используют:

1) в качестве неспецифических лечебных средств, преимущественно для удаления нежизнеспособных тканей;

2) с целью тромболитической терапии при парентеральном применении, а также при неспецифической противовоспалительной терапии;

3) в качестве заместительной терапии, направленной на возмещение дефицита какого-либо фермента, возникающего при некоторых заболеваниях;

4) наконец, используют ингибиторы ферментов, при этом наиболее часто используют тканевые ингибиторы протеаз(трасилол, инипрол, контрикал и др.). Ингибиторы используют, в частности, при фибринолитических кровотечениях.

Вфармации контроль качества ферментных препаратов осуществляется путем определения единиц каталитической активности, содержащихся в единице массы ферментного препарата. Об активности фермента судят по количеству превращенного субстрата или образовавшегося продукта реакции за -оп ределенный промежуток времени. При этом определение активности фермента следует вести в стандартных условиях, т.е. при насыщающих концентрациях субстрата, оптимуме рН среды и постоянной температуре, которые должны поддерживаться в течение всего периода наблюдения. Измерять активность фермента нужно только в начальный отрезок времени, когда реакция протекает линейно.

Наряду с энзимотерапией, ферменты используют как аналитические реагенты.

Вфармацевтической промышленности в качестве аналитических реагентов часто применяют иммобилизованные ферменты. Иммобилизованные ферменты входят как ведущий рабочий компонент в автоматические проточные анализаторы и специальные ферментные электроды, которые используются для анализа лекарственных веществ в процессе их производства. С помощью таких систем налажено автоматическое определение этанола, мочевины, глюкозы, пенициллина, некоторых токсических веществ.

Иммобилизованные ферменты все более широко применяются в фармацевтической промышленности для синтеза лекарственных веществ. В частности, для получения полусинтетических пенициллинов используют иммобилизованную пенициллинамидазу, для получения стероидных гормонов кортизо-

372	17. Фармацевтическая биохимия

ла, преднизолона – иммобилизованные стероидгидроксилазу и стероиддегидрогеназу.

Одним из направлений фармацевтической биотехнологии является микробный синтез лекарственных веществ. Изучение многочисленных биохимических реакций, присущих микроорганизмам, обеспечило выделение из клеток бактерий и грибов вторичных метаболитов, на основе которых созданы гипотензивные, противовоспалительные и противопаразитарные средства. Следует отметить, что микроорганизмы являются наиболее богатыми источниками ингибиторов ферментов, потенциально пригодных для фармакологических целей. Среди них получен, в частности, мевалонил, на основе которого создан препарат мисклерон– противоатеросклеротический препарат, являющийся конкурентным ингибитором b-гидрокси-b-метилглутарил-КоА-редуктазы печени.

Среди фармакологически активных соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками, особо следует отметить антибиотики, а также противогрибковые агенты, противоопухолевые препараты и алкалоиды.

Важнейшим направлением получения лекарственных средств является генно-инженерная биотехнология, основывающаяся на методах рекомбинантных ДНК.

Согласно определению ЮНЕСКО, рекомбинантными ДНК называются молекулы ДНК, полученные in vitro путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами ДНК, способными реплицироваться в клетке. Основу эксперимента составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой бактериальную плазмиду или геном вируса. Затем с помощью вектора рекомбинантную ДНК вводят в

клетку (чаще всего в E. Coli), где она реплицируется. Бактериальная клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток, способных образовывать специфические белки(закодированные в ДНК) в больших количествах, которые и используются в качестве источника для получения лечебного средства. В настоящее время с помощью генноинженерной технологии осуществляется производство инсулина, соматостатина, соматотропина, интерферона и др.

Биохимические исследования также лежат в основе создания новых -эф фективных лекарственных форм лечебных средств, в основе разработки способов повышения биодоступности лекарств. В последнее время все большее распространение приобретает получение и применение препаратов, представляющих собой иммобилизованные ферменты на биологически совместимых деградирующих в тканях полимерах. Такие лекарственные формы успешно применяются в качестве противоопухолевых, антиоксидантных, иммуномодулирующих, фибринолитических препаратов.

17. Фармацевтическая биохимия

373

Большие перспективы открываются в разработке и использовании лекарственных форм с направленным транспортом в зону поражения, в тканимишени. С этой целью используют связывание лекарственного вещества с растворимым полимером высокой молекулярной массы, что приводит к накоплению лекарства в почечных канальцах. Используют связывание лекарственного вещества с системой, высвобождающей лекарство в зоне с кислой рН и повышенной температурой, что свойственно очагу воспаления. Используют лекарственную форму с магнитонаправленным транспортом. Используют связывание лекарственного вещества с молекулами-векторами, для которых определённый орган или клетки являются естественной мишенью, т.е. с гормонами, ферментами, гликолипидами, гликопротеидами и, особенно, иммуноглобулинами (т.е. антителами против компонентов – антигенов органа-мишени).

Наконец, используют включение лекарственных веществ(в том числе– ферментов) в микроконтейнеры – микрокапсулы, «тени» клеток, липосомы с последующей иммобилизацией векторных молекул на наружной поверхности микроконтейнера, что повышает адресность таких микроконтейнеров.

Наиболее многообещающими по сравнению с другими возможными -но сителями представляются липосомы, поскольку они легко метаболизируются в организме, а также обладают большим разнообразием механизмов взаимодействия с биологическими объектами, поскольку возможно огромное разнообразие их состава, размеров и других структурно-функциональных параметров. Их легко изготовить, что такие немаловажно.

Липосомы представляют собой микроскопические пузырьки, стенки которых образованы бислоями полярных амфифильных липидов: глицерофосфолипидов, сфингомиелинов и др. Лекарственные вещества могут взаимодействовать и связываться несколькими областями липосом. Высоко полярные небольшие молекулы растворенных лекарственных веществ включаются во внутреннее водное пространство липосом. Неполярные молекулы включаются внутрь фосфолипидного бислоя. Амфипатические лекарства связываются углеводородными остатками оболочки липосом. Макромолекулы, особенно белки, часто ассоциируют с поверхностью липосом. Взаимодействие липосом с клетками – процесс сложный, еще недостаточно изученный. Доказано в опытах на культуре клеток, что липосомы могут адсорбироваться на поверхности клеток, включаться внутрь клеток путем эндоцитоза, сливаться с плазматической мембраной.

При внутрисосудистом введении мультиламеллярных липосомin vivo, они захватываются, в основном, клетками ретикуло-эндотелиальной системы селезенки и печени, в меньшей мере – клетками легких, практически не поступая в другие клетки, так как не способны преодолевать сосудистые барьеры.

Малые моноламеллярные липосомы способны пересекать стенки капилляров кровеносной и лимфатической систем. Словом, место включения липосом за-

374	17. Фармацевтическая биохимия

висит от их строения (т.е. заряда, размера, состава) и способа их введения (перорального, внутривенного или подкожного).

Для повышения избирательности, адресности действия препаратов, помещаемых в липосомы, в липидную оболочку липосом встраивают векторные молекулы (к примеру – антигены к антителам определенных тканей).

Применение липосом в настоящее время в медицине осуществляется для заместительной ферментотерапии (в частности, для лечения лизосомальных заболеваний), для химиотерапии рака, для лечения некоторых паразитарных заболеваний, для внутрисуставного ревматоидного артрита и др. Список лекарств, которые так или иначе связаны с липосомами, включает более 300 наименований, что свидетельствует о перспективности этой лекарственной формы.

При создании новых лекарственных препаратов, для изучения их фармакологических и токсикологических свойств обязательно применяются разнообразные биохимические методы в экспериментах на нормальных животных и животных с экспериментальными моделями различных патологий. При этом оказалось, что экспериментальные исследования не могут предоставить полную информацию о новых лекарственных средствах, гарантирующих отсутствие нежелательных биохимических реакций при последующем применении этих средств у больных людей. Это связано в ряде случаев со значительными различиями в чувствительности рецепторов к лекарственному веществу и в различии метаболизма лекарств у человека и животных. Последнее повлекло необходимость проведения клинико-биохимических исследований на людях– добровольцах при испытании лекарственных средств, что позволяет уточнить многие экспериментальные биохимические данные и выявить специфические для человека метаболические эффекты лекарственных веществ.

Для проведения испытаний лекарственных средств создаются специальные биохимические программы, которые предусматривают несколько этапов исследований.

Таким образом, биохимия служит фундаментом биофармации– этой теоретической основы технологии лекарств. Биофармация призвана раскрывать взаимосвязь между лекарственным веществом, его лекарственной формой и лечебным эффектом.

Лекарственное вещество, поступившее в организм, проходит в организме сложный путь для того, чтобы осуществился лечебный эффект. Вначале на стадии введения лекарство должно быть освобождено из лекарственной формы, в которую оно облечено (таблетки, мази и т.д.) и пройти путь до намеченного места всасывания. Затем лекарственное вещество всасывается, т.е. транспортируется через биомембраны, подчиняясь законам диффузии, фильтрациии, активного транспорта. При этом на кинетику диффузии и фильтрации оказывает влияние как фармацевтические факторы(например, сопровождающие

17. Фармацевтическая биохимия

375

поверхностноактивные вещества, механическая прочность таблеток и т.д.), так и биохимические факторы, такие как состояние клеточных мембран, ферментативная активность клеток и т.д. Еще большая роль биохимических факторов проявляется на последующих стадиях, когда лекарственное вещество распределяется в жидкостях и тканях, взаимодействуя с рецепторами, подвергается превращению и выведению из организма.

Знания биохимических основ всасывания лекарственных веществ, их распределения в организме, превращения и выделения из организма, необходимые для биофармации, и служат предметом для всестороннего изучения фармацевтической биохимией.

Разбор вопросов фармацевтической биохимии начнем с указания, что все лекарства делятся по отношению к организму человека на аутобиогенные и чужеродные (ксенобиотики).

Действие и превращения аутобиогенных препаратов полностью включается в реакции межуточного обмена веществ и поэтому подробно говорить об этом нет необходимости. Остановимся в основном, на судьбе лекарств– ксенобиотиков.

Ксенобиотиками или чужеродными веществами называются природные или синтетические вещества, не используемые в организме как источники энергии и структурные компоненты тканей.

17.2.Лекарства как чужеродные соединения, их судьба

ворганизме

Кчужеродным соединениям или ксенобиотикам относятся инсектициды, пестициды, консерванты, отходы промышленных предприятий, продукты бытовой химии и другие вещества, которые могут попасть в организм человека с пищей или другими путями. К их числу относятся также многие лекарственные вещества, так как большинство лекарственных веществ синтетического происхождения, многие лекарственные вещества растительного происхождения и некоторые вещества минерального происхождения являются для организма чужеродными.

Являясь чужеродными для нормальных метаболических путей и обладая зачастую в то же время биологической активностью, эти вещества могут изменять и нарушать нормальное течение обменных процессов, вызывать отравление и смерть, а в условиях патологии при нарушении обмена веществ некоторые из них в ряде случаев могут нормализовать метаболизм и тем самым обусловить выздоровление больного. Последнюю группу ксенобиотиков относят

клекарственным веществам.

Организм обладает защитными биохимическими механизмами, которые способны в определённой мере нейтрализовать активность чужеродныхсо