Часть I

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

ЗАНЯТИЕ 1

Дата________________

Тема: ВВЕДЕНИЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЛАБОРАТОРИЮ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

План занятия

1.Знакомство с рабочим местом и режимом работы в микробиологической лаборатории.

2.Знакомство с иммерсионным микроскопом и правилами работы с ним.

3.Упражнение в микроскопии на готовых препаратах с приме­нением сухих и иммерсионной систем.

4.Правила обращения с культурами микробов.

5.Приготовление препарата "раздавленная капля".

6.Приготовление и окраска препарата тушью по Бурри (негативный способ окраски).

7.Знакомство со специальными методами микроскопии (люминесцентная микроскопия).

Методические указания

§ I. А) Оборудование рабочего места.

На рабочем столе должно быть все необходимое для работы: микроскоп, иммерсионное масло, бактериологическая петля, спиртовка, набор красок, промывалка и ванна для промывки препаратов, предметные стекла и салфетки для протирания их, штатив для пробирок с культурами, пинцет, фильтровальная бумага для высушивания препара­тов и банка для отработанных стекол.

Из личных вещей студента на рабочем месте допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делают записи и зарисовки. Ничего лишнего (в том числе учебников и других книг) на рабочем столе не должно быть.

б) Режим работы в бактериологической лаборатории.

Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соблюдения ряда правил личной и общественной профилактики. Каждый студент обязан работать в халате, на голову надевать шапочку или косынку, не курить и не принимать пищу в лаборатории, избегать суеты. По окончании работы необходимо вымыть руки с мылом.

§ 2. Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающаяся способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно (т.е. не сливаются в одну). Разрешающая способ­ность объектива ограничивается такими недостатками оптической сис­темы, как сферическая и хроматическая аберрации ,дифракция и т.д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции имеет мес­то в любой оптической системе. Оно ограничивает разрешающую способ­ность оптических систем. Разрешающая способность объектива с уче­том явлений дифракции описывается следующей формулой:

А = 0,61 ,

где А - минимальное расстояние между двумя точками объекта (разрешающая способность);

n - показатель преломления среды между препаратом и фронталь­ной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n=1,51);

α- угол между оптической осью объектива и наиболее крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата;

λ- длина световой волны;

0,61 - коэффициент, который учитывает геометрические факторы при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.

Величина n·Sinα постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на опра­ве объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95.

Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональная его числовой апертуре и об­ратно пропорциональна длине волны света, используемого при микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны порядка 0,55 микрона и иммерсионным объективом с максимальной нумерической апертурой 1,60 разрешающая способность равна:

А = 0,61

Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.

Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увели­чено окуляром лишь настолько, чтобы оно просматривалось под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это - полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полез­ное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4-1,6, составляет 1400-1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров никаких дополнительных деталей к структуре препарата, разрешаемой объективом, не выявляет.

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:

1)Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).

2)Диафрагма конденсора должна быть полностью открыта.

3)Во всех без исключения случаях работа ведется с плоским зеркалом, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.

Наряду с увеличением и нумерической апертурой одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:

для объектива с увеличением х8 - 8,5 мм;

для объектива с увеличением 40х - 0,4 мм;

для объектива с увеличением 90х - 0,2 мм.

Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать микроскоп на препарате. Кроме того, чтобы правильно и быстро установить освещение, необходимо, чтобы объектив находился от препарата на свободном рабочем расстоянии.

Порядок работы с микроскопом

1.Проверить состояние осветительного аппарата (поднять кон­денсор, открыть его диафрагму, поставить плоское зеркало).

2.Положить на столик микроскопа исследуемый препарат и поставить слабый сухой объектив (8x) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния (для данного объектива 5-7 мм).

Рис.1 Дрожжевые клетки объектив 8x

Рис.2 Дрожжевые клетки объектив 40x

Рис.3 Дрожжевые клетки объектив 90x

3. Глядя в окуляр и вращая зеркалом, произвести предварительную установку освещения,

4. Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата. При использовании слабого сухого объектива в поле зрения, кроме препарата, может быть видно изображение источ­ника света, т.е. оконной рамы и других предметов, находящихся за окном.

5.Движением зеркала поставить в центре поля зрения наиболее светлый участок оконной рамы (например, участок неба с облаками), после чего можно переходить на микроскопию с сильным сухим или иммерсионным объективами. При этом мешающие детали исчезают из поля зрения, Если этого не происходит, то следует осторожно приподнять или опустить конденсор на 1-1,5 мм.

6.Поставив сильный сухой или иммерсионный объектив, ни в коем случае нельзя опускать тубус микроскопа, глядя в окуляр. Необходимо под контролем глаза, глядя сбоку, опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего, а затем, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока появится мелькание препарата. После этого точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону. При фокусировке микроскопа полезно левой рукой слегка двигать препарат по поверхности предметного столика.

§ 3. Пользуясь изложенными сведениями, необходимо научиться быстро и правильно устанавливать препарат в Фокусе при всех трех объективах. Рассматривая препарат, следует обратить внимание на резкое увеличение числа разрешаемых подробностей при работе с иммерсионным объективом по сравнению с сухими объективами.

Зарегистрировать рабочий номер своего микроскопа и указать в таблице его основные параметры.

Рис.4. Микроскоп Обозначения: 1 - окуляр; 2 - тубус; 3 -штатив(колонка и ножка);4- макрометрический винт; 5- микрометрический винт;6- зеркало; 7 - конденсор;8- предметный столик;9- объектив; 10 – револьвер.

Параметры рабочего микроскопа.

Тип (марка)__________________________________________________

Заводской номер_____________________________________________

Увеличение окуляра__________________________________________

Номера объективов: 8x________________________________________

40x_______________________________________

90x_______________________________________

Нумерическая апертура

объективов: 8x________________________________________

40x_______________________________________

90x_______________________________________

Общее увеличение

с объективом 90x_______________________________________

Порядковый номер________________________________________

Роспись_________________________________________________

§ 4. Необходимо твердо усвоить основные приемы бактериологической техники: обращение с культурами микробов, использование бактериологической петли, спиртовок, способы обеззараживания использованного материала и отработанных стекол.

При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать следующие два основные принципа: 1 - не загрязнить микробами окружающей среды и не заразить самого себя и 2 - не загрязнить культуру посторонними микробами из окружающей среды, так как точная идентификация исследуемого возбудителя заболевания возмож­на лишь при условии выделения и сохранения его в чистой культуре.

Культуру бактерий сохраняют обычно на жидких и плотных питательных средах в пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками. При всех манипуляциях с культурой (приготовление мазка, пересев ее с одной среда на другую и т.д.) используют стерильную бакте­риологическую петлю из металлической проволоки. Правильно приготовленная петля диаметром от I до 5 мм должна быть полностью замкнута и не должна тлеть лишнего свободного конца. Петлю стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки, держа ее сначала вертикально, затем проводят 3-4 раза через пламя прилегающую к петле часть петледержателя.

Для соблюдения вышеуказанных принципов в случае приготовления бактериологическую петлю берут в правую руку как ручку или карандаш, а пробирку держат в левой руке между большим и указательным пальцами с тыльной стороны кисти почти в горизонталь­ном положении. При этом должна быть хорошо видна поверхность питательной среды с культурой бактерий.

Простерилизовав петлю, правой рукой захватывают пробку, прижимая ее мизинцем к ладони, освобождают ее небольшим поворотом, вынимают над пламенем горелки и, не выпуская пробку из руки (в таком положении она сохраняется в течение последующих манипуляций) обжигают края пробирки. Петлю вводят в пробирку, остужают прикосновением к внутренней стороне стекла и берут ею небольшое коли­чество культуры, стараясь не захватить при этом питательной среды. Вынув петлю, опять обжигают края пробирки, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку. Не выпуская петли из руки, ставят пробирку в штатив и приступают к приготовлению мазка. После этого пет­лю стерилизуют и ставят в штатив.

С соблюдением этих основных правил производят и все другие манипуляции с культурами бактерий - пересев из пробирки в пробирку» из пробирки в чашку, из чашки в чашку и т.п.

В случае попадания культуры микробов на руки, другие предметы и пол необходимо немедлено протереть руки и загрязненные предметы ватой, смоченной дезинфицирующим растворов, а пол залить этим же раствором. Через 30 минут руки можно вымать с мылом.

§ 5. На чистое сухое предметное стекло нанести с помощью бактериологической петли каплю воды. Прокаленной и остуженной петлёй внести в небольшое количество (одну петлю) микробной массы и равномерно перемешать с водой. Петлю прокалить и поставить в штатив. Накрыть каплю чистым покровным стеклом и придавить его слегка рукояткой петли. Полученную "раздавленную каплю" поместить на предметный столик микроскопа и промикроскопировать сначала со слабым сухим объективом, затем с сильным сухим объективом и, наконец, с иммерсионным. Для установки препарата в фокусе следует найти вначале при малом увеличении капли, вывести его в центр поля зрения и затем по нему ориентироваться.

При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, что достигается опусканием конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы,

§ 6. На чистое предметное стекло наносят каплю воды и рядом с ней несколько больших размеров каплю туши. В каплю воды вносят небольшое количество исследуемой культуры (получается облачко помутнения). Прокалив и остудив петлю(чтобы сжечь оставшуюся массу бактерий), готовят равномерную взвесь бактерий. Затем соединяют эту каплю с каплей туши, тщательно перемешивают и размазывают по стеклу тонким слоем. Высушивают мазок на воздухе и микроскопируют с иммерсионным объективом.

При микроскопии препарата рекомендуется начинать с более светлых участков его, а затем переходить на более темные. Необходимо помнить, что при негативных способах окраски микробы остаются не убитыми.