- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
1. Вирусологические:
а)размер - 22-30 нм;
б)геном - однонитчатая нефрагментированная позитивная
в)устойчивость к эфиру;
г) повышение терморезистентности в присутствии ионов Mg++ и Ca++
д) устойчивость к желчи, кислотам, щелочам (в диапазоне рН 3,0 - 10,0);
е)способность размножаться в определенных культурах клеток;
ж)число капсомеров (60);
э) устойчивость во внешней среде.
2. Эпидемиологические:
а)выраженная сезонность заболеваний (лето, осень);
б)фекально-оральный путь распространения;
в)выделение вируса из - кишечника, носоглотки, ликвора, крови,
г)обнаружение в сточных водах;
д) преимущественное поражение детей до 12 лет;
е)широкое носительетво среди здоровых людей,
Для диагностики ОКЗ вирусной этиологии могут быть использованы следующие методы:
1.Иммуноэлектронной микроскопии.
2.Иммунологические реакции: коагтлютинации, преципитации в геле (различные варианты), РСК, иммунофлуоресцентный метод, иммуноферментный метод, радиоиммунный метод.
3.Биологические методы.
4.Использование РНК-зондов.
Рис.8 В. Схема строения вирионов вируса группа А.
1-спираль РНП; 2-белок РВ1; РВ2 и РА; 3-гемагглютинин; 4-липидный слой; 5-нейраминидаза; 6-мембранный белок; 7,8-мономер и триммер гемагглютинина; 9,10-мономер и тетрамер нейраминидазы.
Г. Особенности генома вируса гриппа А
Геном вируса гриппа представлен однонитчато фрагментированной негативной РНК с м.м. 5 мегадальтон. Всего фрагментов 8, генов 10. Фрагменты 7 и 8 несут по две рамки считывания.
Фрагмент |
Белок |
Молекулярная масса |
Функция |
1 |
P3(PB2) |
85 кДа |
Эндонуклеаза |
2 |
P1(PB1) |
96 кДа |
Транскриптаза |
3 |
P2(PA) |
87 кДа |
Репликаза |
4 (1768 н.о.)* |
Гемагглютинин HA |
Мономер 75 кДа HAI-50 кДа HA2-25 кДа |
Взаимодействует с рецептором клетки |
5 (1517 н.о.) |
Нуклеопротеид NP |
60 кДа |
Структурная и регуляторная |
6 (1413 н.о.) |
Нейраминидаза NA |
Мономер 50-60 кДа Тетрамер 200-250 кДа |
Обеспечивает диссеминацию вируса, отщепляя нейраминовую кислоту |
7 (1027 н.о.) |
Матриксный белок: М1 М2 |
25 кДа 11 кДа |
Регуляторная роль в морфогенезе вириона |
8 (890 н.о.) |
Неструктурные белки:N1 N2 |
23 кДа 11кДа |
Регуляторные белки |
* - нуклеотидных остатков
Классификация и характеристика тогавирусов
Семейство тогавирусов содержит 4 рода, два из которых - альфа-и флавивирусы являются арбовирусами. Последние характеризуются тем, что вызывают инфекции, передающиеся членистоногими, в основном комарами и клещами. Два других рода включают вирусы, не вызывающие трансмиссивных инфекций(рубивирусы и пестивирусы).
Род альфа - вирусов включает 21 серотип, типичным является вирус Синдбис.
Вирионы имеют сферическую форму с диаметром 70 нм. Тип симметрии кубический, икосаэдры. Имеют наружную липопротеидную оболочку, обладают гемагглютинирующими свойствами. Геном представлен однонитчатой линейной позитивной РЖ с м.м. около 4 млн.
Род флавирусов включает 41 серотип, почти все они размножаются в переносчиках. К этому роду относятся вирусы клещевого весенне-летнего энцефалита и омской геморрагической лихорадки, природные очаги которых имеются на территории нашей страны.
Вирионы имеют сферическую форму с диаметром 40-50 нм, тип симметрии кубический, имеют внешнюю липопротеидную оболочку, обладают гемагглютинирующими свойствами.
Геном представлен однонитчатой линейной позитивной РЖ с м.м. около 4,0 - 4,5 млн.
Известны две разновидности вируса клещевого энцефалита и соотвественно две формы болезни - более тяжелый дальневосточный клещевой энцефалит и более легкий европейский. Человек заражается при укусе клещей, а также алиментарным путем (через молоко инфицированного скота). Близким к вирусу клещевого энцефалита является вирус геморрагической омской лихорадки, заражение которой происходит также через укусы клещей.
Методы диагностики заболеваний, вызываемых альфа и флавивирусами
1.Заражение мышей внутрь мозга.
2.Заражение культур клеток (выраженный цитопатический эффект).
3.Использование иммунологических реакций для идентификации вирусов и определения антител к нему: реакция нейтрализации, реакция торможения гемагглютинации, РСК, иммунофлуоресцентный метод, иммунофэрментный и радиоиммунный методы.
ЗАНЯТИЕ 4
Дата_______________
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИИ
План занятия
I. Вирусологический диагноз гриппа (окончание):
а)вскрытие куриных эмбрионов зараженных вирусом гриппа. Определение наличия вируса гриппа в аллантоисноВ жидкости с помощью реакции гемагглютинации. Определение типа вируса с помощью РТГА.
2.Вирусологический диагноз полиомиелита (окончание):
а) регистрация роста вируса полиомиелита в клетках культуры ткани, цитопатический эффект;
б)цветная реакция.
3.Микробиологическая диагностика вирусных гепатитов (А,В,С,Е, дельта-гепатиты):
а) способы обнаружения вирусов,
б) использование иммунологических реакций. Методика "захвата" антител, относящихся к классу IgМ, для диагностики гепатита А. Применение реакции обратной пассивной гемагглютинации для обнаружения в сыворотке больных или носителей поверхностного антигена вируса гепатита В. Методика постановки РОПГА.
Методические указания
§ I. Вскрыть, соблюдая необходимые правила (см.занятие 3), куриный эмбрион и отсосать пастеровской пипеткой аллантоисную жидкость. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяется с помощью реакции гемагглютинации вначале на стекле, а затем в пробирках (для определения титра вируса).
Реакция гемагглютинации обусловлена способностью ортомиксовирусов, имеющих гемагглютинин, взаимодействовать с мукопептидами оболочки эритроцитов ряда животных и птиц. В результате этого взаимодействия происходит склеивание эритроцитов.Реакцию ставят в бактериологических пробирках или на предметных стеклах. Для получения эритроцитов у петухов берут кровь из подкрыльцовой вены стерильным шприцем и дефибринируют в баночке с бусами. Эритроциты фильтруют через марлю, осаждают центрифугированием и трижды отмывают физиологическим раствором. Из осадка эритроцитов готовят 1-2%-ную взвесь на физиологическом растворе. В пробирках готовят последовательные разведения вируса - 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. - в объеме I мл и добавляют равные объемы взвеси эритроцитов. Для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации в одну из пробирок эритроциты добавляют не к вирусной суспензии, а к физиологическому раствору. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат при 370 на 30 мин. Учет реакции производят по форме осадка эритроцитов. Там, где прошла агглютинация, осадок эритроцитов напоминает развернутый зонт. Если агглютинации нет, эритроциты оседают на дно пробирки в вида круглого диска с ровными краями. То последнее разведение вируса, которое еще дает агглютинацию эритроцитов не менее, чем на 3+, носит название гемагглютинирующего титра вируса.
Поставить РТГА на стекле для определения типа вируса в аллантоисной жидкости (см.схему).
§ 2. О наличии и размножении вируса полиомиелита в клетках культуры тканей узнают по цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки ткани гибнут и под микроскопом обнаруживаются дегенеративные изменения. Клетки образуют симпласты, часто округляются и отторгаются пластами от стенок пробирки. В культуре ткани, не зараженной вирусами, под влиянием продуктов метаболизма клеток рН среды изменяется в кислую сторону и цвет индикатора меняется на желтый. Если в исследуемом материале имеется вирус полиомиелита, то клетки гибнут, рН среды меняется незначительно - среда сохраняет розовый цвет.
Рис.1 Определение типа вируса грипп с помощью реакции торможения гемагглютинации.
В каплю аллантоисной жидкости прибавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов.
Рис.2 ЦПЭ, вызванный вирусом полиомиелита в культуре ткани.
Рис.3 Бляшкообразование в культуре ткани, зараженной вирусом полиомиелита.