§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:

Количество клеток в 1 мл = ;

где а - количество клеток в камере;

3600 - количество квадратов в камере;

1/4000 мм - объем одного квадрата.

Так как в одном мл 1000 мм , то полученный результат умножают на 1000. После первого разведения (1:200) концентрация клеток дос­тигает 600000-1300000 на 1 мл. Клетки куриных эмбрионов разводят той же средой до концентрации 400000 клеток в I мл.

Взвесь клеток разливают по I мл в пробирки, которые плотно закрывают стерильными резиновыми пробками для того, чтобы среда не выщелачивалась. Пробирки помещают в термостат при 37⁰ почти в горизонтальном положении (под углом в 5⁰ ) в специальных штативах. Через 3-4 дня при микроскопии виден сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

§ 7. В настоящее время имеется много стабильных штаммов клеток, пассируемых вне организма в течение многих лет. Эти культуры клеток называют перевиваемыми культурами ткани, или растущими культурами ткани. К ним относятся штаммы клеток, полученные из злокачественных: опухолей и из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Неla-клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер-2 - клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штамм клеток Детройт-6 - клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) штаммы клеток А-0 и А-1 -клетки амниона человека; 5) штамм клеток ЕRК-клетки почек эмбриона кролика; 6)штамм клеток СОЦ - клетки сердца обезьяны Macacus cynomolgus и многие другие. Эти штаммы клеток применяются только для диагностики вирусных заболеваний. Они не могут быть использованы для изготовления вакцинных вирусных препаратов, так как культуры клеток, полученные даже из нормальных тканей, в процессе длительных пересевов приобретают характер злокачественного роста.

Посмотреть под микроскопом демонстрационные препараты культур ткани и зарисовать.

§ 8. Для поддержания роста клеток пересев делают через 6-7 дней. Количество клеток за это время увеличивается в 4-10 раз. При пересеве для отслаивания клеток от стекла используют 0,02%-ный раствор версена (можно использовать раствор трипсина). Версен готовят на солевых растворах без кальция и магния. Поэтому при добавлении его к культуре клеток он связывает кальций и магний, и клетки отслаиваются от стекла.

Предварительно из пробирки или флакона удаляют питательную среду, затем в пробирку вносят 0,5 мл раствора версена, а во флаконы-матрацы объемом 150-200 мл - 10 мл и 25 мл версена соответствен­но. Сосуды помещают в термостат на 20-30 минут, после чего слегка встряхивают. Взвесь вносят в пробирки, центрифугируют при 1000 об/мин 5-10 минут, раствор версена удаляют, а клетки ресуспендидуют в питательной среде, Подсчитывают в камере Горяева концентрацию клеток и взвесь разводят до концентрации 200000 клеток в 1 мл. Взвесь вносят по 1-2 мл в пробирки. Пробирки закрывают резиновыми пробками, отмечают карандашом по стеклу лицевую сторону пробирок и помещают их в наклонном положении в термостат.

Подсчитать концентрацию смытых клеток с помощью камеры Горяева и сделать посев культуры клеток в пробирки.

§ 9. Просмотреть монослой выросших клеток и заразить культуру ткани вирусом осповакцины. Техника заражения состоит в следующем. Вирус вакцины разводят синтетической средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой ткани стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят I мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают ее резиновой пробкой и помещают в термостат в горизонтальном штативе.

§ 10. Существует несколько методов заражения куриных эмбрионов; на хорионаллантоиснух) оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5-11 дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности (живые эмбрионы подвижны с хорошо развитыми сосудами) и опревоздушной камеры и места расположения эмбриона. Место на столе, где производят манипуляции покрывают салфеткой, смоченной в растворе хлорамина.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу над воздушной камерой обрабаты­вают спиртом, йодом, повторно спиртом, обжигают, прокалывают ножни­цами небольшое отверстие, через которое в полость воздушного мешка вводят одну браншу и срезают скорлупу над ним. Затем анатомическим пинцетом захватывают в склада- и осторожко снимают внутренний листок подскорлуповой оболочки. Под ней находится хорионаллантоисная оболочка, на которую пастеровской пипеткой наносят исследуемый материал в количестве 0,2-0,5 мл. Отверстие скорлупы закрывают стерильным стеклянным колпачком, который закрепляют на яйце расплавленным парафином. Зараженное яйцо помещают в термостат при 37⁰ на 48 часов.

3аражение в аллантоисную полость. После подготовительной работы скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафи­ном.

Заражение в амниотическую полость. После удаления скорлупы над воздушной камерой бранши пинцета вводят в аллантоисную полость в направлении эмбриона на глубину 2-2,5 см, захватывают амниотическую оболочку, выводят ее на глубину прокалывают иглой шприца и в амниотическую полость вводят материал в количестве 0,1 мл. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком и парафинируют.

Заражение в желточный мешок. (Этим методом пользуются для выделения риккетсий). Исследуемый материал вводат 5-8-дневным эмбрионам длинной иглой (4-5 см) через небольшое отверстие в скорлупе над воздушной камерой на глубину 2-3 см. При этом надо не повредить зародыш. Во время манипуляции он должен находиться ниже желточного мешка. Просмотреть с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона. Ввести эмбриону на хорионаллантоисную оболочку вирус осповакцины или в аллантоисную полость вирус гриппа.

Рис.5 Фибробласты куриных эмбрионов. Окраска по Романовскому.

Рис.6 Клетки амниона человека. Окраска по Романовскому.

Рис.7 Схема строения куриного эмбриона.

Контрольные вопросы.

Что такое бактериофаг?

Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?

Что содержится в головке бактериофага?

Как устроен хвостик фага и каково его назначение?

Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?

Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?

Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?

Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия?

Как выделяют фаги из объектов внешней среды?

Какова методика определения титра фага по Грациа?

Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?

Чем отличаются вирусы от всех остальных живых организмов?

Что такое вирион? Что такое капсид, нуклеокапсид, пеплос (суперкапсид)?

Какой тип симметрии может иметь нуклеокапсид?

Какие признаки используются для классификации вирусов?

Почему вирусы считаются облигатными паразитами?

Какие методы используются для культивирования вирусов?

Как заражают новорожденных мышеи?

Что собой представляют тельца Негри и какими методами их окрашивают?

Что такое культура ткани?

Ткани каких органов используются для получения культур клеток?

Как получают культуру первично-трипсинизированной ткани?

Что такое перевиваемые культуры ткани?

Какие Вы знаете штаммы перевиваемых клеток?

Какие среды и солевые растворы применяют для выращивания и для обработки культур ткани?

Как подсчитывают количество клеток и с какой целью?

В каком положении ставят пробирки в термостат и сколько вре­мени выращивают клетки до заражения их вирусом?

По каким признакам судят о размножении клеток?

Как делают пересев клеток для поддержания данного штамма в лабораторных условиях?

Как отбирают пробирки с культурой ткани для заражения вирусом?

Как выглядят растущие клетки?

Как готовят вируссодержащий материал для заражения культуры ткани?

На сколько времени ставят зараженные пробирки в термостат?

Каково строение куриного эмбриона?

Какого возраста эмбрионы используются для заражения?

Как определяет место расположения эмбриона при овоскопии?

Как обрабатывается эмбрион перед заражением?

Какие существуют метода заражения куриного эмбриона?

На сколько времени ставят зараженный эмбрион в термостат для размножения вируса?

Приложение к занятию I.

Рис.8 А. Строение фага.

Б. Основные свойства вирусов, отличающие их от остальных живых организмов.

1.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа - ДНК или РНК. Все другие организма содержат нуклеиновые кислоты обоих типов.

2.Воспроизведение вирусов осуществляется из одной их нуклеиновой кислоты, в то время как прочие организмы репродуцируются из совокупности своих составных частей.

3.Вирусы неспособны к росту и бинарному делению.

4.У вирусов отсутствуют собственные знергообразущие системы.

5.У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

Отсутствие у вирусов собственных энергообразующих и белоксинтезирующих систем характеризует их как абсолютных паразитов.

В. Критерии современной классификации вирусов.

1.Нуклеиновая кислота: тип, число нитей, процентное содержа­ние, молекулярный вес, содержание гуанина и цитозина.

2.Морфология: тип симметрии или псевдосимметрия, число капсомеров для вирусов с кубической симметрией, наличие внешней липопротеидной оболочки, форма, размеры вирионов.

3.Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность.

4.Белки: количество структурных белков и их локализация, аминокислотный состав.

5.Липиды

6.Размножение в тканевых культурах: особенности репликации.

7.Круг поражаемых хозяев: особенности патогенеза инфекционного процесса; онкогенные свойства.

8.Устойчивость к физическим и химическим факторам (гамма-лучи, термоинактивация при 37⁰и 56⁰ , действие жирорастворителей и отдельных катионов).

9.Антигенные свойства.

Г. Классификация вирусов (1985г.)

Семейство	Род		Типовые представители
1	2		3
РНК-содержащие вирусы
Picornaviridae	Enterovirus Cardiovirus Rbihovirus Aphtovirus	Вирус полиомиелита Вирус гепатита А (тип 72) Вирус энцефаломиокардита Риновирусы человека Вирус ящура
Reoviridae	Reovirus Rotavirus Orbivirus	Реовирус человека, тип I.
Togaviridae	Alphavirus Flavivirus Rubivirus Pestivirus	Вирус Карельской лихорадки Вирус желтой лихорадки Вирус краснухи
Bunyaviridae	Bunyavirus Phlebovirus Nairobivirus Uukuvirus	Вирус Буньямвера Вирус Крымско-конголезской лихорадки
Orthomyxoviridae	Вирус гриппа А Вирус гриппа В	Вирус группа H2N2
Paramyxoviridae	Paramyxovirus Morbillivirus Pneumovirus	Вирус парагриппа человека тип1 Вирус Кори Респираторно-синцитиальный вирус
Rhabdoviridae	Vesiculovirus Lyssavirus	Вирус везикулярного стоматита Вирус бешенства
Filoviridae	Filovirus	Вирусы Марбург и Эбола
Retroviridae Подсемейства: Oncovirinae Lentivirinae Spumavirinae	Oncovirus Lentivirus	Вирус СПИДа
Arenaviridae	Arenavirus	Вирус лимфоцитарного хориоменингита
Coronaviridae	Coronavirus	Коронавирус человека
Caliciviridae	Calicivirus	Вирус Норвольк
ДНК-содержащие вирусы
Poxviridae	Orthopoxvirus Parapoxvirus Avipoxvirus Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus	Вирус натуральной оспы
Herpesviridae Подсемейства: Alphaherpesvirinae Betaherpesvirinae Gammaherpesvirinae		Вирусы простого герпеса, ветряной оспы, опоясывающего герпеса Вирус цитомегалии человека и мышей Вирус Эпштейн-Барр
Adenoviridae	Mastadenovirus Aviadenovirus	Аденовирусы млекопитающих (41 тип аденовирусов человека)
Hepadnaviridae	Hepadnavirus B	Вирус гепатита B человека
Papovaviridae	Papovavirus	Обезьяний вирус 40 (SV40)
Parvoviridae	Parvovirus Densovirus Dependovirus	Аденоассоциированные вирусы человека (аденосателлиты)

Д. Для выделения вирусов используют следующие методы:

а)заражение лабораторных животных;

б)заражение куриных эмбрионов;

в)заражение культур тканей.

Характеристика культур тканей.

I. Однослойные культуры клеток

1.Первично-трипсинизированная культура ткани - взвесь клеток, полученная путем обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папайя и др.). Трипсинизацией достигается разделение кле­ток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду,растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани. Первично-трипсинизированная культура ткани выдерживает несколько пересевов, а затем погибает.

2.Перевиваемые клетки - культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время.

II. Суспензия клеток.

Е. Типы вирусных геномов

РНК-геномы

1.Одноцепочечная единая РНК, обладающая матричной активностью (позитивная РНК) - вирус полиомиелита и др.

2.Одноцепочечная единая РНК, не обладащая матричной активностью (негативная РНК). Вирион имеет транскриптазу - парамиксовирусы, рабдовирусы и др.

3.Одноцепочечная фрагментированная РНК, не обладающая матричной активностью (негативная РНК). Вирион имеет транскриптазу - ортомиксовирусы.

4.Двухцепочечная фрагментированная РНК. Вирион имеет транскриитазу - реовирусы.

5.Вирусы, геном которых представлен двумя идентичными нитями позитивной РНК (диплоидный геном). Вирионы имеют обратную транскриптазу- ретровирусы.

ДНК-геномы

6.Одноцепочечная линейная ДНК - парвовирусы.

7.Одноцепочечная кольцевая ДНК - фаги М13, ØX174.

8.Двухцепочечная линейная ДНК - вирус герпеса и др.

9.Двухцепочечная кольцевая ДНК - паповавирусы, вирус гепатита В и др.

10.Двухцепочечная ДНК с ковалентносвязанным терминальным гидрофобным белком - аденовирусы.

11.Двухцепочечная ДНК, замкнутая на каждом конце ковалентной связью - вирус оспы.

Ж. Особенности репликации вирусов

1.Двунитчатая ДНК - обычная полуконсервативная репликация.

2.Однонитчатая ДНК. Ее репликация происходит через стадии репликативной формы и промежуточной репликативной формы.

3.Однонитчатая РНК. Репликация происходит через две стадии. Вначале на вирионной РНК (в РНК) синтезируются комплементарные РНК (кРНК). Затем на кРНК синтезируются вирионные РНК.

4.Репликация однонитчатой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует минус-цепь ДНК, а затем на ней синтезирует плюс-нить ДНК. Двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза вРНК.

5.Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы. Вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, а затем вирусная ревертаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, на которой затем достраивает плюс-цепь ДНК.