§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.

Б. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (продолжение).

§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".

B. Микробиологический диагноз дизентерии.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из чистых культур дизентерийных бактерий, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. Изучить биохимические свойства дизентерийных бактерий по демонстрационным наборам сред "пестрого ряда". Обратить внимание на рост дизентерийных бактерий и кишечной палочки на среде Ресселя.

Регистрация результата роста культуры на среде Рапопорт.

Агглютинация гемокультуры.

Рисунок 1. Реакция О–агглютинации.

Рисунок 2. Реакция Н-агглютинации.

Рисунок 3. Реакция Ви-агглютинации.

Регистрация результатов биохимической активности корпускулы.

Куль-тура	Глюко-за	Лакто-за	Ман-нит	Саха-роза	Индол	Моло-ко	Серово-дород	Среда Пешкова

Реакция агглютинации выделенной от больного культуры.

Рисунок 4.

Заключение. ____________________________________________________________

§ 2. Произвести посев испражнений больного дизентерией на чашки с дифференциально-диагностической средой Плоскирева. Бактериальной петлей каплю испражнений нанести на пластинку бактоагара Плоскирева и тщательно рассеять штриховым способом на половине чашки (1 чашка дается на двух студентов).

Контрольные вопросы.

Какие микроорганизмы являются возбудителями дизентерии?

Какие принципы используют для классификации возбудителей дизентерии?

Как отличаются различные виды дизентерийных бактерий по биохимическим свойствам?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида Зонне?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида флекснера?

По каким признакам бактерии вида флекснера подразделяются на серовары и подсеровары?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида Бойда?

Каковы особенности патогенеза дизентерии?

Какие микробиологические методы используются для диагностики дизентерии?

Какой материал исследуется для выделения возбудителей дизентерии и на какие питательные среды его засевают?

Где в организме больного локализуется возбудитель дизентерии?

Как следует брать материал от больного дизентерией?

Рисунок 5. Возбудитель пищевой токсикоинфекции со среды Плоскирева. Окраска по Граму.

Рисунок 6. Shigella sonnei. Окраска по Граму.

Рисунок 7. Shigella flexneri. Окраска по Граму.

Методы микробиологической диагностики дизентерии.

А. Бактериологический.

Рисунок 8.

Б. Аллергический.

Внутрикожная проба с дизентерином (проба Цуверкалова).

По каким признакам идентифицируют возбудителей дизентерии?

Каково различие между типовыми и групповыми диагностическими агглютинирующими дизентерийными сыворотками?

Для чего необходимо серологическое типирование возбудителей?

Какова методика кератоконьюктивальной пробы и каково ее значение?

Каковы методика и цель определения чувствительности дизентерийных бактерий к антибиотикам?

В каких случаях и как применяют дизентерийный бактериофаг?

В чем заключается сущность методов определения чувствительности бактерий Зонне к колицинам и типов колицинов, продуцируемых шигеллами?

Как ставится аллергическая проба Цуверкалова?

Чем обусловлена вирулентность дизентерийных бактерий?

Приложение к занятию 7.

А. Ферментативные типы шигелл Зоне.

Типы	Ферментация
	рамнозы	ксилозы
1	+	-
2	(+)	-
3	+	+
4	+	(+)

Обозначения: + ферментация в первые сутки,

(+) ферментация замедленная,

- отсутствие ферментации.

Б. Метод колициногенотипирования.

Метод колициногенотипирования разработан английскими исследователями Абботом и Шенноном (1958) и основан на определении колициногенотипов шигелл Зонне по действию этих бактерий на 15 индикаторных культур, из которых 13 принадлежит к виду шигелл Зонне, 1 - s. dysenteriae 2 (Штуцера-Шмитца) и 1 - Escherichia сoli К-12 ROW.

С помощью этого набора индикаторных культур в настоящее время выявлено 17 колициногенных типов бактерий Зонне.

Испытываемую культуру сеют на МПА с генцианвиолетом двумя линейными штрихами параллельно диаметру чашки. После инкубирования при 37° в течение 48 часов выросшую культуру убивают парами хлороформа и удаляют с поверхности среды узким краем стерильного шлифованного предметного стекла. На поверхность агара наносят свежие культуры индикаторных штаммов в виде линейных штрихов, пересекающих линии посева исследуемой культуры. Посевы индикаторных штаммов инкубируют 18-20 часов при 37° и производят учет результатов по наличию или отсутствию зон торможения роста индикаторных культур и их размерам.

Регистрируют результаты следующими условными обозначениями:

++++ - зона торможения 15-20 мм;

+++ - зона торможения 10-15 мм;

++ - зона торможения более 5 мм;

+ - зона торможения 4-5 мм;

± - зона торможения меньше 4 мм;

- - отсутствие зоны торможения.

Полученный спектр действия исследуемой культуры на индикаторные штаммы сопоставляют со стандартной схемой титрования и присваивают этой культуре соответствующий колициногенотип.

Классификация бактерий рода Shigella.

Подгруппа и ее характеристика	Вид и серовары	Подсеровары	Антигенная формула
			Типовой антиген	Групповые антигены
Подгруппа А. Не ферментирует маннита. Серологически каждый серовар отличается от других.	S. dysenterica 1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	11
	12
Подгруппа В. Обычно ферментируют манит. Серологически серовары родственны друг другу.	S. flexneri 1	1а	1	2,4
		1в	1:S	6:2,4
	2	2а 2в	2	3,4
			2	7,8
	3	3а 3в 3с	3	6:7,8
			3	6:3,4
			3	6
	4	4а 4в	4	В:3,4
			4	В:6:3,4
	5		5	7,8
			5	(3,4)
	6	Некоторые штаммы ферментируют глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа	6	2,4
	Вариант X		-	7,8
	Вариант Y		-	3,4
Подгруппа С. Обычно ферментируют манит. Серологически серовары отличаются друг от друга.	S. boydii Серовары 1-18
Подгруппа D. Обычно ферментируют манит, поздно лактозу и сахарозу.	S. sonnei Обычно вырастают колонии двух фаз – мелкие (имеют плазмиду), крупные, плоские (не имеют плазмиды)

Методика колицинотипирования при помощи колициногенных штаммов.

Определение спектра чувствительности культур Зонне к колицинам проводят при помощи эталонных колициногенных штаммов Фредерика:

Наименование штамма			Тип продуцируемого колицина
E. coli	Ca-18	B
E. coli	Ca-23	D
E. coli	Ca-38	E + I
E. coli	Ca-42	F
E. coli	Ca-46	G
E. coli	Ca-53	I
E. coli	Ca-62	J + I
E. coli	Ca-235	K
E. coli	Ca-7	V
E. freundii	Ca-31	A
S. boydii	p-1	S1
S. dispar	p-15	S4
S. dispar	p-14	S5
S. sonnei	p-9	S3 + 1

Схема определения колицингенотипов шигелл Зонне.

Рисунок 9.

Колицинотипирование, т.е. определение спектра чувствительности культур Зонне к колицинам, определяют следующим образом.

Свежие эталонные колициногенные штаммы Фредерика, выросшие на среде Ресселя, сеют уколом петли в соответствующие квадраты чашки с 1,5%-ным МПА, подкрашенным генцианвиолетом, и инкубируют при 37º в течение 24 часов. Выросшие колонии бактерии убивают парами хлороформа, и поверхность агара заливают 2,5 мл расплавленного 0,7%-ного МПА, содержащего 2 капли 6-часовой испытуемой бульонной культуры шигелл Зонне. После 20-часового роста при 37° производят учет результатов опыта. При наличии чувствительности к колицинам испытуемого штамма бактерии Зонне вокруг колоний колициногенных культур образуются зоны задержки роста подобно зонам задержки роста вокруг дисков с антибиотиками. Культура считается чувствительной к колицину, если ширина задержки роста бактерий более 2 мм. Результаты регистрируют плюсами: + - зона задержки 2 мм; ++ - зона задержки 2-5 мм, +++ - зона задержки 5-10 мм, ++++ - зона задержки более 10 мм.

В.

Вирулентность дизентерийных бактерий обусловлена наличием у них факторов адгезии и колонизации, инвазии. (Эти факторы патогенности контролируются главным образом плазмидами). Кроме того, шигеллы способны вырабатывать 2 типа экзотоксинов: цитотонины (термолабильный и термостабильный) и цитотоксины (способностью вырабатывать цитотоксины шигеллу наделяют конвертирующие умеренные фаги).

Патогенность шигелл определяется с помощью кератоконъюнктивальной пробы на морской свинке.

Типовые и индикаторные культуры набора Абботта и Шеннона для колициногенотипирования шигелл Зонне.

Типовые колициногенные культуры		Индикаторные культуры
Наименование штамма	Колициногенотип	Наименование штамма	Оригинальный № по схеме Абботта и Шеннона	Регистрационный № по списку Интернационального центра по шигеллам в Лондоне
S. sonnei	1A	S. sonnei	2	100031
S. sonnei	1B	S. sonnei	56	100032
S. sonnei	2	S. sonnei	17	100033
S. sonnei	3	S. sonnei	2M	100034
S. sonnei	3A	S. sonnei	38	100035
S. sonnei	4	S. sonnei	56/56	100036
S. sonnei	5	S. sonnei	56/98	100037
S. sonnei	6	S. sonnei	R 1	100038
S. sonnei	7	S. sonnei	R 6	100039
S. sonnei	8	S. dysenteriae 2	M 19	CTC8218
S. sonnei	9	S. sonnei	2/7	100040
S. sonnei	10	S. sonnei	2/64	100041
S. sonnei	11	S. sonnei	2/15	100042
S. sonnei	12	S. sonnei	R5	100043
S. sonnei	13	E. coli K-12	ROW	100044
S. sonnei	14
S. sonnei	15

Схема колициногенотипирования шигелл Зонне по Абботту и Шеннону.

	Индикаторные культуры
	2	56	17	2M	38	56/56	56/98	R 1	R 6	M 19	2/7	2/64	2/15	R5	ROW
1A	+	+	+	-	-	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+
1B	+	+	+	-	-	+	+	-	+	+	-	-	-	-	+
2	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+
3	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
3A	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+
4	+	+	+	V	+	-	-	+	+	-	+	+	+	-	+
5	+	+	+	V	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+
6	-	+	-	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+
7	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
8	+	-	+	-	+	-	-	+	-	-	-	-	+	-	+
9	+	+	+	-	V	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+
10	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	-	-	+	-	+
11	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
12	+	+	-	-	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+
13	-	+	+	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+
14	+	+	+	V	+	+	+	+	+	-	+	+	+	-	+
15	+	-	+	+	+	-	-	+	-	-	+	+	+	+	+

Обозначения: + наличие зоны торможения индикаторных штаммов,

- отсутствие зоны торможения,

V – вариабельные результаты.

Занятие 8.

Дата________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

А. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (окончание).

1. Учет результатов посева на среды "пестрого ряда" и микроскопия выделенной культуры.

2. Разбор серологической классификации сальмонелл.

3. Агглютинация выделенной культуры на стекле с адсорбированными монорецепторными 0- и Н-сыворотками.

Б. Микробиологический диагноз дизентерии (продолжение).

I. Изучение результатов посева, сделанного на предыдущем занятии. Посев подозрительной колонии на МПА, среду Ресселя и среды "пестрого ряда".

В. Микробиологический диагноз эшерихиозов.

1. Посев испражнений больных эшерихиозом детей на среды Эндо и Левина.

Методические указания.

A. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (окончание).

§ 1. Зарегистрировать результаты посева выделенной культуры на среда "пестрого ряда", промикроскопировать посевы на МПА и зарисовать. На основании изучения биохимизма и морфологии выделенной культуры решить вопрос о ее принадлежности к роду сальмонелл и записать в тетради.

§ 2. Разобрать особенности антигенного строения и принципы современной серологической классификации сальмонелл (демонстрация схемы).

§ 3. Поставить реакцию агглютинации выделенной культуры на стекле с адсорбированными монорецепторными 0- и Н-сыворотками.

Результаты реакции агглютинации зарисовать и записать в тетради.

Б. Микробиологический диагноз дизентерии (продолжение).

§ 1. Внимательно рассмотрев посевы на дифференциально-диагностических средах Левина и Плоскирева, найти колонии, подозрительные на дизентерийные (бесцветные, прозрачные). Часть колонии промикроскопировать с окраской по Граму и зарисовать, а оставшуюся часть засеять на скошенный МПА, среду Ресселя, среду Пешкова для определения подвижности и среды "пестрого ряда".

B. Микробиологический диагноз эшерихиозов.

§1. Произвести посев испражнений ребенка, больного эшерихиозом, на чашки с дифференциально-диагностическими средами Эндо и Левина.

Биохимические свойства культуры, выделенной от больного токсикоинфекцией.

Культура	Глю-коза	Лактоза	Манит	Сахароза	Индол	H²S	Молоко	Среда Пешкова

Предварительное заключение: _____________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Контрольные вопросы.

Какие микроорганизмы являются основными представителями нормальной кишечной микрофлоры?

Какое значение имеет кишечная микрофлора для организма человека?

В каких случаях возникает дисбактериоз?

Рисунок 1. Микроскопия выделенной культуры сальмонелл. Окраска по Грамму.

Рисунок 2. Реакция агглютинации выделенной культуры сальмонелл с монорецепторными О- и Н-сыворотками.

Заключение____________________________________________________________________________________________________________________________________

Рисунок 3. Бактерии из колонии, подозрительной на дизентерийную. Окраска по Грамму.

Какие препараты применяют для восстановления состава нормальной микрофлоры кишечника?

Почему кишечную палочку считают санитарно-показательным микроорганизмом при загрязнении внешней среды?

Что такое коли-титр и коли-индекс?

Каково антигенное строение кишечной палочки?

Как выделяют чистую культуру диареегенной кишечной палочки?

Какой антиген (0 или К) определяют в реакции агглютинации с живой культурой?

Как обнаруживают специфический 0-антиген у кишечной палочки?

По какому антигену окончательно судят о принадлежности бактерий к патогенному серовару?

Что собой представляют колицины и какое значение имеет определение их типа?

На какие категории и по каким признакам подразделяют диареегенные кишечные палочки?

Какими факторами патогенности обладают энтеротоксигенные кишечные палочки? Каков генетический контроль их синтеза?

Чем обусловлена патогенность энтеропатогенных кишечных палочек?

Чем обусловлена патогенность энтероинвазивных кишечных палочек?

Чем объясняется некоторое антигенное и патогенное сходство энтероинвазивных кишечных палочек и шигелл?

Бактериологическое исследование испражнений при эшерихиозах.

Рисунок 4.

С чем связана патогенность знтерогеморрагических кишечных палочек?

Каков генетический контроль биосинтеза шигаподобных экзотоксинов у энтерогеморрагических вариантов кишечной палочки?

Каков механизм действия термостабильных и термолабильных энтеротокоинов?

Какова молекулярная структура энтеротоксинов?

Каковы основные способы заражения диареегенными кишечными палочками?

Какие категории диареегенных кишечных палочек чаше всего вызывают внутрибольничные вспышки?

Можно ли отличить колонии диареегенных кишечных палочек от колоний непатогенных кишечных палочек на дифференциально-диагностических средах? Если можно, то в каких случаях?

Приложение к занятии 8

А. Семейство кишечных бактерий объединяет группу родственных видов, среди которых много патогенных и условно патогенных представителей. Важнейшими представителями семейства являются бактерии из рода эшерихиа, рода сальмонелла и рода шигелла. Все они - мелкие грамотрицательные аспорогенные палочки, с закругленными концами, размером 0,5-0,8x1,5-3,0 микрона, подвижные или неподвижные, факультативные анаэробы, нетребовательны к питательным средам, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа или только кислоты, восстанавливают нитраты в нитриты, в большинстве не обладают протеолитическими свойствами, индофенолоксидазоотрицательны; место обитания - кишечник; механизм заражения - фекально-оральный.

Б. Факторы патогенности диареегенных E.coli.

Факторы	Международное название
	Полное	Символы
Термостабильный энтеротоксин
Термолабильный энтеротоксин
Цитотоксины:
Шигаподобный токсин
Vero - токсин
Инвазивность٭
Факторы колонизации٭
Фактор адгезии энтеропатогенных E. coli к клеткам Hep-2
Адгезия к клеткам Henle-407

٭ - имеются в виду CFA/I, CFA/II, CFA/III, CFA/IV. Известны и другие факторы адгезии и колонизации.

В. Классификация диареегенных Escherichia coli.

Категория	Серогруппы	Серовары
ETEC – энтеротоксигенные E. coli	06, 08, 015, 020, 025, 027, 063, 078, 080, 085, 0115, 0128ас, 0139, 0148, 0153, 0159, 0167.	06:Н16, 08:Н9, 011:Н27, 015:Н11, 020:Н-, 025:Н-, 027:Н7, 063, 078:Н11, 0128:Н7, 0148:Н28, 0149:Н10, 0159:Н20, 0167.
EIEC – энтероинвазивные E. coli	028ас, 029, 0124, 0136, 0143, 0144, 0152, 0164, 0167.	028ас:Н-, 0112ас:Н-, 0124:Н, 0124:Н32, 0136:Н-, 0143:Н-, 0144:Н-, 0152:Н-, 0159:Н-, 0164, 0167:Н4, 0167:Н5, 0124:Н30.
EPEC – энтеропатогенные E. coli	Класс 1. 055, 086, 0111, 0119, 0125, 0126, 0127, 0128ав, 0142. Класс 2. 018, 044, 0112, 0114.	018ас:Н7, 020ав:Н26, 026:Н-, 026:НII, 028ас:Н-, 044:Н34, 055:Н-, 055:Н6, 055:Н7, 086а:Н-, 086а:Н34, 0111ав:Н12, 0114:Н10, 0114:Н32, 0119:Н-, 0119:Н6, 0125ас:Н21, 0126:Н-. 0126:Н7, 0127:Н-, 0127:Н9, 0127:Н21, 0128ав:Н2, 0128ас:Н12, 0142:Н6, 0158:Н23, 0159.
EHEC – энтерогеморрагические E. coli	0157, 026, 0111, 0145.	0157:Н7
EAEC – энтероадгерентные E. coli		Не выяснены (провизорная группа)

Г. Классификация сальмонелл (Salmonella).

Род сальмонелл включает свыше 2000 серовариантов.

На основе нумерической таксономии и ДНК-связей в нем выделен единственный вид Salmonella choleraesuis с 6 подвидами: S. choleraesius, S. salamae, S. arisonae, S. diarisonae, S. houtenae, S. bonhori.

Основные биохимические признаки	Подроды
	1	2	3	4	5	6
	Подвиды
	S. choleraesius	S. salamae	S. arisonae	S. diarisonae	S. houtenae	S. bonhori
Лактоза	-	-	+	+	-
Салицин	-	-	-	-	+
Дульцит	+	+	-	-	-	+
Желатин	-	+	+	+	+
d-тартрат	+	-или×	-или×	-или×	-или×
Малонат	-	+	+	+	-
KCN	-	-	-	-	+	+
Тест на β-галактозидазу	-	-или×	+	+	-	+

Примечание: × - ферментация поздно.

Занятие 9.

Дата________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

A. Микробиологический диагноз дизентерии (окончание).

1. Учет результатов посева на среды "пестрого ряда".

2. Агглютинация выделенной культуры с дизентерийными сыворотками.

3. Колициногенотипирование и определение колициночувствителъности шигелл Зонне. Демонстрация. Опыт зарисовать.

Б. Микробиологический диагноз эшерихиозов (продолжение).

1. Изучение выросших колоний и агглютинация их на стекле со смесью ОК-сывороток.

2. Посев агглютинирующей колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры.

B. Микробиологический диагноз холеры.

1. Изучение морфологии и биохимических свойств холерного и холероподобного вибрионов.

2. Исследование испражнений холерного больного: микроскопия, посев на щелочную пептонную воду и щелочный МПА.

3. Ускоренная диагностика холеры (демонстрация).

4. Исследование воды на наличие холерного вибриона (разбор методики).

Методические указания.

A. Микробиологический диагноз дизентерии (окончание).

§ 1. Учесть и зарегистрировать в таблице результаты посева на средах "пестрого ряда", промикроскопировать с окраской по Граму выросшую культуру на МПА, зарисовать ее и сделать ориентировочное заключение о предполагаемом виде бактерий.

§ 2. Определить вид и тип выделенных дизентерийных бактерий с помощью реакции агглютинации на стекле со специфическими видовыми и типовыми дизентерийными агглютинирующими сыворотками. Результаты записать в тетради.

Б. Микробиологический диагноз эшерихиозов (продолжение).

§§ 1-2. Проверить выросшую на среде Эндо или Левина колонию кишечной палочки в ориентировочной реакции агглютинации с поливалентными ОК-сыворотками ОКА,ОКВ,ОКС,ОКД и ОКЕ на стекле. Учет результатов производится по четырехкрестной системе. При отрицательной реакции капля остается гомогенно мутной. Оставшуюся часть колонии, давшей положительную реакцию агглютинации с одной из поливалентных сывороток, необходимо пересеять на скошенный МПА и среду Эндо (Левина). Если агглютинация не происходит, то прежде чем дать отрицательный ответ, в реакции агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками ОК испытать не менее 10 различных колоний.

B. Микробиологический диагноз холеры.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из чистой культуры водного вибриона, окрасить их по Граму, промикроскопировать и зарисовать. Изучить биохимические свойства холерного и холероподобных вибрионов по демонстрационным наборам сред "пестрого ряда".

§ 2. Приготовить и промикроскопировать с окраской по Граму препарат-маэок из испражнений "холерного" больного, обратить внимание на наличие вибрионов, зарисовать. Одну петлю испражнений засеять на пептонную воду в пробирке, другую петлю испражнений засеять на пластинку щелочного МПА так, чтобы получить изолированные колонии.

§ 3. Для исследования воды без предварительной фильтрации берут ее не менее 1 л, определяют рН, доводят ее насыщенным раствором соды до 7,6-7,8. Затем добавляют к 900 мл воды 100 мл основного раствора пептона (пептона 10 процентов, хлористого натрия 5 процентов, азотнокислого калия 1 процент и углекислого натрия 20 процентов).Засеянную однопроцентную пептонную воду (первая среда обогащения) разливают в колбы и флаконы по 250 мл и ставят в термостат на 5-8 часов. Дальнейшее исследование проводят по обычной схеме.

Регистрация результатов посева дизентерийных бактерий

на среды "пестрого ряда".

Культура	Глю-коза	Лактоза	Маннит	Сахароза	Индол	Серо-водород	Среда Пешкова

Предварительное заключение: _____________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Серологическая идентификация выделенной культуры шигелл

(обязательно предварительно учесть биохимические свойства).

Диагностические сыворотки	Результаты
А. Для расщепляющих манит:
1. Основная поливалентная сыворотка, содержащая антитела к шигеллам Флекснера (1-6) и Зонне
2. Поливалентная Флекснера
3. Зонне (содержащая антитела к 1 и 2 фазе) 4. Флекснера 6.
5. Серовароспецифические Флекснера к антигенам I, II, III, IV, V, VI.
6. Групповые Флекснера ( к антигенам 3, 4, 6, 7, 8)
7. Поливалентная Бойда.
8. Серовароспецифические ( к антигенам 1-18) для определения серовара вида Бойда.
9. Моноспецифические Зонне (для фаз I и II)
Б. Для нерасщепляющих манит:
1. Поливалентные к виду шигелла дизентерии (подгруппа А) (1-2; 3-7; 8-10)
2. Серовароспецифические, входящие в данную поливалентную сыворотку для определения серовара (1-12)

Методы микробиологической диагностики холеры.

А. Бактериологический.

Рисунок 1.

Рисунок 2. Выделенная культура шигелл. Окраска по Граму.

Рисунок 3. Вибрион. Окраска по Грамму.

Рисунок 4. Мазок из испражнений"холерного" больного. Окраска по Граму

Рисунок 5. Реакция агглютинации кишечной палочки со смесью ОК-сывороток.

1 - опыт; 2 – контроль.

Методы ускоренной диагностики холеры.

А. Иммунофлуоресцентный.

Рисунок 6.

Мазки обрабатывают люминесцентной сывороткой и рассматривают в люминесцентном микроскопе. При наличии в исследуемом материале холерного вибриона в первом мазке произойдет свечение вибрионов, во втором - свечение отсутствует.

2. Реакция пассивной гемагглютинации.

Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антителъный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.

Б. Серологический.

Для серологической диагностики холеры можно использовать реакцию агглютинации, реакцию обнаружения копроантител и реакцию определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов).

Реакцию агглютинации ставят по обычной методике с сывороткой больного, инактивированной нагреванием. В качестве антигена используют 5-часовую агаровую культуру холерного вибриона штамма Огава и отдельно штамма Инаба. Антитела в крови больного появляется с 5-го дня от начала заболевания. Реакция считается положительной при титре сыворотки 1:40 и выше.

0-агглютинины у больных и вибрионосителей можно определить также в инактивированной сыворотке, разведенной 1%-ной пептонной водой от 1:10 до 1:1280 в объеме 1 мл. В пробирки вносят по 0,1 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов. После 2 часов инкубирования при 37° и выдерживания на холоде в течение ночи учитывают результат.

Для определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов) инактивированную сыворотку больного разводят на холоде в растворе комплемента 1:20 в объеме 0,45 мл от 1:10 до 100000. В качестве комплемента использует сыворотку морской свинки, проверенную на отсутствие естественных бактериолизинов. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,05 мл суточной агаровой культуры холерных вибрионов с концентрацией 20000 микробных тел в 1 мл. Контролями служат пробирка, в которой отсутствует сыворотка, и пробирка, в которой отсутствует комплемент. Все пробирки инкубируют при 37º в течение 1 часа, затем помещают на холод и микропипеткой высевают по 0,05 мл из каждой пробирки на чашки с питательным агаром. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37°. Через 24 часа подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с посевами из опытных и контрольных пробивок. За титр вибриоцидных антител (бактериолизинов) принимают то максимальное разведение сыворотки, при высеве из которого вырастает в 2 раза меньше колоний, чем при высеве из контрольных пробирок.

По аналогичной методике можно определить содержание вибриоцидных антител и в фильтрате содержимого кишечника (испражнений) больного холерой.

Можно определить титр вибриоцидных антител и без предварительной инактивации комплемента и без добавления стандартного комплемента. Исследуемую сыворотку в этом случае наносят каплями (в соответствующем разведении) на чашку с питательной средой, на которую предварительно наносят каплю свежей культуры и рассевают её по всей поверхности среды с помощью шпателя. На месте нанесения капель сыворотки, в которых еще содержатся вибриоцидные антитела и комплемент в достаточном количестве, чтобы вызвать лизис вибриона, роста его не будет ("стерильные пятна").

Для обнаружения антител к холерогену (антитоксинов) в настоящее время применяются иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы.

Кроме того, для обнаружения гена, контролирующего синтез холерогена, разработан метод ДНК-зонда.

Контрольные вопросы.

Каковы морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности холерного вибриона?

Каково антигенное строение холерного вибриона?

По каким признакам отличают семейство Vibrionaceae от семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae?

По каким признакам отличают род Vibrio от родов Aeromonas, PLesiomonas?

По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобных?

Какие существуют биотипы холерного вибриона?

Как происходит заражение при холере?

Где в организме больного локализуется холерный вибрион?

Какие микробиологические методы применяют для диагностики холеры?

Какой материал берут от больного для исследования?

Какой трупный материал подвергают исследованию?

Какие правила следует соблюдать при взятии, пересылке и исследовании материала при подозрении на холеру?

Какие питательные среды применяют для выделения холерного вибриона?

Как выделяют чистую культуру холерного вибриона?

На основании каких признаков идентифицируют холерный вибрион?

Какова сущность иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения холерного вибриона?

По каким признакам отличают классический вибрион от вибриона Эль Тор?

Какие токсины образует холерный вибрион? Какое действие оказывает энтеротоксин (холероген) на организм человека?

В чем заключается принцип патогенетического лечения больных холерой?

Как ставят пробу со специфическими холерными монофагами?

В чем заключается биологический метод определения энтеротоксигенности (холерогенности) вибрионов?

Какие серотипы различают у холерных вибрионов?

Какие основные биологические свойства парагемолитических вибрионов? Как происходит заражение ими и какие они вызывают заболевания?

Какое основное отличие галофильных вибрионов от холерных и холероподобных?

Какие метода обнаружения холерогена Вы знаете?

Какова природа и структура холерного энтеротоксина (холерогена)?

Каковы косвенные доказательства отсутствия токсигенных свойств у холерного вибриона?

Какими функциями обладают фрагменты А и В холерогена?

С чем связана способность некоторых холероподобных вибрионов вызывать холероподобные диареи?

Каким образом идентифицируют холероподобные, т.е. не относящиеся к 01-группе, вибрионы?

Приложение к занятию 9.

Возбудитель холеры относится к семейству Vibrionaceae , которое включает в себя несколько родов, в том числе роды: Vibrio, Аеromonas, Plesiomonas.

К роду vibrio относятся грамотрицательные, не образующие спор и капсул палочки, с одним изгибом или прямые, с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительные, образующие кислоту без газа из d-глюкозы путем гликолиза по схеме Эмбден-Мейергофа (до молочной кислоты), имеющие декарбоксилазы лизина и орнитина, лишенные аргининдигидролазы, разжижающие желатину, восстанавливающие нитраты в нитриты и не образующие сероводорода.

Представители рода Aeromonas имеют аргининдигидролазу. Представители рода Plesiomonas имеют все три фермента: лизин- и орнитин-декарбоксилазы и аргининдигидролазу.

Род Vibrio включает следующие виды: V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.anguillarum, V.fisheri, V.costicola.

С 1985 года в этот род включено уже более 20 видов.

Вид V.choleгае разделяют на следующие биовары: Vibrio cholerae (в том числе V.eltor), имеющий 01-антиген; V.fincler-prior - включает все холероподобные вибрионы, не относящиеся к 01-серологической группе. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.

Характеристика холерных и холероподобных

вибрионов.

Признаки	Вибрионы
	холерные	холероподобные
Форма	в виде запятой	в виде запятой
Подвижность	+	+
Биохимические группы по Хейбергу	I	I-VIII
Агглютинация холерной сывороткой 0-1 подгруппы	+	-
Лизис специфическим монофагом	+
Диастатическая активность	+
Устойчивость к хлору при экспозиции 30 минут	предельная доза 0,4 мг/л воды	предельная доза 0,5-2 мг/л воды

Дифференциальные признаки биоваров холерных вибрионов

(классического и Эль Тор).

Признаки	Биотипы
	классический	Эль Тор
Гемолиз эритроцитов барана	- (+)	+ (-)
Агглютинация куриных эритроцитов	- (+)	+ (-)
Рост на среде с полимиксином (50 ед/мл)	-	+
Лизис фагом С (IV группа Мукерджи) в рабочем разведении (10¯³)	+	-
Лизис фагом Эль Тор 2 в рабочем разведении (10¯¹ - 10¯²)	-	+
Реакция Фогес - Проскауэра	-	+

Холерный вибрион представлен тремя сероварами:

Серотипы	Антигенная формула	Агглютинация сыворотками
		О	Огава	Инаба
Огава	AB	+	+	-
Инаба	AC	+	-	+
Гикошима	ABC	+	+	+

Дифференциальные признаки патогенных и непатогенных

галофильных вибрионов.

Признак	Vibrio parahaemolyticus	Vibrio alginolyticus
Рост в отсутствие NaCl	-	-
Рост в присутствии 7% NaCl	+	+
Рост в присутствии 10% NaCl	-	+
Ферментация сахарозы	-	+
Реакция Фогес - Проскауэра	-	+
Феномен роения	-	+
Гемолиз на среде с 7% NaCl	+	-

Биохимическая характеристика вибрионов по Хейбергу.

Углеводы	Группы
	1	2	3	4	5	6	7	8
Манноза	+	-	+	-	+	-	+	-
Арабиноза	-	-	+	+	-	-	+	+
Сахароза	+	+	+	+	-	-	-	-

ЗАНЯТИЕ 10.

Дата_______

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(окончание).

План занятия.

А. Микробиологический диагноз эшерихиозов (окончание).

1. Постановка реакции агглютинации с живой и гретой культурами кишечной палочки, определение ее серологической группы и серотипа.

Б. Микробиологический диагноз холеры (окончание).

1. Микроскопия препаратов-мазков, приготовленных из пленки на пептонной воде и из колоний на МПА. Агглютинация культур из колоний с холерной О-сывороткой.

В. Изучение иммунопрепаратов, применяемых для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, вызываемых бактериями кишечной группы. Демонстрация и разбор.

Г. Правила взятия и пересылки материала при исследовании на кишечную группу микробов. Особенности взятия и пересылки материала при подозрении на холеру. Разбор методов.

Методические указания.

А. Микробиологический диагноз эшерихиозов (окончание).