- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, то он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цветов.
Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными (светящимися) люминесцентными красителями - флуорохромами (например, раствор акридинового оранжевого 1:5000 - 1:10000). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускаются через сине-фиолетовый фильтр. Под действием
Рис.5 Стрептобацилла (“Раздавленная капля”)
Рис.6 Негативная окраска по Бури; объектив 90x
Рис.7 Люминесценция дрожжей, обработанных акридиновым оранжевым; объектив 40x
Рис.8 Оптическая схема люминесцентного микроскопа
этого коротковолнового излучения окрашенные акридиновым оранжевым бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызывающий люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром микроскопа ставят "запирающий" желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающие желтые, зеленые и красные лучи.
В результате при наблюдении в микроскопе на темном фоне будут видны микробные клетки, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. При окраске акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом, а находящаяся в цитоплазме рибонуклеиновая кислота - красным цветом.
Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными растворами красителей, не причиняющих вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с большим эффектом может -быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.
Флуоресцирующими красителями можно обрабатывать диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенным бактериям. Краситель, например, изотиоцианат флуоресцеина, химически соединяется с глобулинами иммунной сыворотки и таким образом как бы избирательно метит антитела.
Люминесцирующие сыворотки могут быть использованы для идентификации выделенных культур бактерии и для ускоренной индикации патогенных микробов во внешней среде и в выделениях больных.
Сущность иммунофлуоресцентного метода исследования заключается в том, что из исследуемого материала готовят мазок и после высушивания и фиксации обрабатывают его люминесцирующей сывороткой (см. занятие 12). При наличии в исследуемом мазке гомологичных бактерий, вследствие адсорбции на них меченных флуоресцирующим красителем антител, в люминесцентном микроскопе на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Центральная часть клеток не светится. Присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.
Демонстрация в люминесцентном микроскопе бактерий, обработанных акридиновым оранжевым и люминесцирующей сывороткой.
Контрольные вопросы
От чего зависит разрешающая способность микроскопа?
Почему иммерсионные объективы имеют более высокую разрешающую способность по сравнению с сухими объективами с тем же отверстным утлом?
Что такое нумерическая апертура и по какой формуле она определяется?
Чему равны разрешающая способность современных оптических микроскопов и их полезное увеличение?
На какой высоте должен находиться при микроскопии конденсор?
Каким зеркалом следует пользоваться при работе на микроскопах, снабженных конденсором?
Чему равны свободные рабочие расстояния объективов микроскопов и для чего необходимо их знать?
Каким винтом микроскопа следует производить наводку на резкость?
Как следует производить наводку" микроскопа на резкость, чтобы избежать повреждения объектива и препарата?
Как выявить наличие загрязнения в окуляре?
Как правильно приготовить бактериологическую петлю?
Как следует держать пробирку, петлю и пробку при взятии материала для приготовления препарата?
Как предохранить культуру микроорганизма от загрязнения из воздуха?
Как производится негативная окраска препарата по Бурри?
Как выглядят бактерии в препарате, приготовленном по Бурри?
Как должно быть установлено освещение при микроскопии неокрашенных препаратов ("раздавленная капля")?
Как устроен люминесцентный микроскоп?
Каким светом наиболее целесообразно вызывать люминесценцию препарата и почему?
Каково назначение желтого окулярного светофильтра в люминесцентном микроскопе?
Что такое флуорохромирование, какие флуорохромы чаще применяются?
В чем заключается принцип иммунофлуоресцентного метода исследования?
Приложение к ЗАНЯТИЮ 1
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИИ
Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала определяют вид возбудителя заболевания по форме, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными красителями.
Бактериологический. Этот метод основан на выделении чистой культуры возбудителя заболевания и его идентификации (определение вида микроба).
Серологический. Метод основан на определении специфических антител в крови больных или переболевших инфекционными заболеваниями к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций (агглютинации, пассивной гемагглютинации, связывания комплемента, преципитации и других).
Биологический. В основе этого метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя.
Аллергический. С помощью этого метода обнаруживают повышенную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности. Для аллергических проб используют препараты, которые называются аллергенами.
ПРИЗНАКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ (для определения вида микроба)
Морфологические - форма, величина и характер расположения микробов друг к другу.
Тинкториалные - способность микробов окрашиваться различными красителями.
Культуральные - особенности роста микробов на жидких и плотных питательных средах.
Биохимические - способность микроорганизмов потреблять различные вещества (углеводы, белки и другие) с образованием характерных конечных продуктов, или наличие у микроорганизмов различных ферментов (уреаза, цистиназа и другие).
Антигенные - особенности химического состава микробных клеток (антигенной структуры), выявляемые с помощью специфических диагностических иммунных сывороток,
Чувствительность к специфическим фагам - способность бактерий лизироваться эталонными специфическими фагами.
Биологические свойства. Токсигенность - способность продуцировать экзотоксин. Чувствительность к определенным колицинам или тип синтезируемых колицинов.
Определение понятий "микроорганизмы" и "вид"
Микроорганизмы - это невидимые простым глазом живые существа, включающие в себя представителей всех царств жизни - плазмиды, вирусы, прокариоты (эубактерии и архебактерии) и эукариоты. Они стоят на низших ступенях эволюции и играют важную роль как в общей экономике природы, так и в патологии человека, животных и растений А.И.Коротяев).
Вид - совокупность микроорганизмов, имевших общий корень происхождения, сходный генотип (более 80% гомологии ДНК) и максимально близкие фенотипические признаки и свойства (А.И.Коротяев).
ЗАНЯТИЕ 2
Дата____________________
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
План занятия
А. Микроскопические методы исследования
I 1. Устройство электронного микроскопа.
2. Методы электронномикроскопического препарирования:
а)приготовление пленок-подложек;
б)негативное и позитивное контрастирование;
в)метод оттенения.
3.Методы получения ультратонких срезов:
а)способы фиксации и заливки биологических объектов; б)приготовление стеклянных ножей;
в) ознакомление с устройством ультрамикротома и получением ультротонких срезов.
4.Исследование ультратонких срезов в электронном микроскопе. Демонстрация.
5. Знакомство со специальными методами микроскопии (конденсор темного поля, фазовоконтрастный микроскоп).
Б. Морфология микроорганизмов
1. Морфология бактерий: шаровидные, палочковидные и извитыеформы. Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков.
2.Жгутики бактерий. Демонстрация готовых препаратов.
3.Наблюдение подвижности бактерий в препарате "висячая капля" и c помощью фазовоконтраcтного микроскопа. Метод полужидких сред (Пешкова).
Методические указания
А. Микроскопические методы исследования