§2. Реакция лизиса.

а)Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пастеровс­кой пипеткой каплю гемолитической сыворотки (инактивированной в отношении комплемента), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по I капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки). С помощью бактериальной петли перемешивают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только

в опытной капле. Она наступает быстрее при легком покачивании стекла и осторожном подогревании. В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит (так как там отсутствуют антитела);

б)реакция гемолиза. На чистое стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от второй капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли чистой пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После этого в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю вместо комплемента добавляют физиологичес­кий раствор в том же объеме. После этого содержимое всех капель тщательно перемешивают (перед каждым перемешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения наступления реакции стек­ла могут быть слегка подогреты высоко над пламенем спиртовки или в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит только в первой капле, в которой содержатся все необходимые для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во второй капле про­изойдет реакция агглютинации, так как в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых изменений не произойдет.

Результаты реакции агглютинации

	Контроль	Разведения сыворотки
		1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
Степень агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Результат РПГА

	Контроль	Разведения сыворотки
		1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:1640	1:1280
Степень агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

§ 3. Реакция связывания комплемента. Разбор методики постановки РСК, определения рабочих доз антигена, комплемента, получения гемолитической сыворотки. Для постановки основного опыта РСК необходимы следующие ингредиенты:

а)антиген, рабочая доза которого уже оттитрована;

б)исследуемая сыворотка;

в)комплемент, рабочая доза которого должна быть также оттит­рована:

г) гемолитическая сыворотка с известным титром;

д)3 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана;

е)физиологический раствор.

Рис.1 Реакция гемолиза Обозначения: 1 - гемолитическая сыворотка +эритроциты +комплемент; 2- гемолитическая сыворотка + эритроциты +физиологический раствор; 3- физиологический раствор + эритроциты +комплемент.

Антиген для реакции связывания комплемента готовится из соответствующих микроорганизмов (бактерий, вирусов) или может быть неспецифическим (в реакции Вассермана - липоидный экстракт из органов). В связи с тем, что антиген может обладать антикомплементарным действием, перед постановкой опыта он титруется, т.е. устанавливается его рабочая доза. Титром антигена считается такая доза последнего, которая не вызывает задержки гемолиза. Для работы берут дозу антигена, равную половине его титра.

Источником комплемента для РСК служит свежая (или высушенная) сыворотка крови морской свинки. Титром комплемента называется его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром.

Гемолитическую сыворотку получают иммунизацией кролика эритроцитами барана. Титром гемолитической сыворотки называется то макси­мальное разведение ее; которое, будучи смешано с равным объемом (0,5 мл) 10%-ного раствора комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси эритроцитов в течение 1 часа при 37⁰ . В основной опыт бе­рется сыворотка, разведенная до 1/3 своего титра. Так, если титр сы­воротки 1:1200, то в опыт берется сыворотка в разведении 1:400.

Исследуемая сыворотка (т.е. сыворотка больного) перед опытом инактивируется при 56⁰ в течение 30 минут, чтобы исключить действие имеющегося в ней комплемента. В реакцию следует брать сыворотку в разведении 1:5.

Все ингредиенты для РСК берут в дозе по 0,5 мл. Недостающее количество компонентов доводят до указанного объема физиологическим раствором. Титрование ингредиентов производят накануне постановки реакции.

Результаты РСК учитывают дважды: после инкубации в термостате и на следующий день (через 18-20 часов). Интенсивность реакции оценивают по 4-баллъной системе:

++++ полнея задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами не окрашена, эритроциты в осадке;

+++ неполная задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов;

++частичная задержка гемолиза: жидкость красная, осадок эритроцитов;

+ слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно-красная, незначительный осадок эритроцитов;

± следы задержки гемолиза: гемолиз почти полный, при взбалтывании со дня поднимается незначительный осадок в виде облачка;

— полный гемолиз: лаковая кровь, осадок отсутствует.

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты	Номера пробирок
	1	2	3
Испытуемая сыворотка	0,5	0,5	—
Антиген	0,5	—	0,5
Физиологический раствор	—	0,5	0,5
Комплемент	0,5	0,5	0,5
В термостат при 37^0 на 1 час
Гемолитическая сыворотка	0,5	0,5	0,5
Эритроциты барана	0,5	0,5	0,5
В термостат при 37^0 на 30-60 минут