- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
Сделать посев почвенной взвеси на среду Вильсон-Блера в трубки Вейон-Виньяля. Для этого исходная взвесь почвы последовательно разводится в трех пробирках с 10 мл физиологического раствора*. Несколько капель из последней пробирки засеять в расплавленную и остуженную до 420-450 среду Вильсон-Блера. Среда с засеянным материалом перемешивается и насасывается в трубки Вейон-Виньяля, которые после застывания среды помещают в термостат.
Рис.1 Микрофлора пальцев. Окраска по Граму
Рис.2 Микрофлора зева. Окраска по Граму
Рис.3 Латинское морфологическое название бактерий из изолированной колонию.
* Под физиологическим раствором здесь и далее следует понимать О,85%-ный раствор NaСl.
Рис. 4 Латинское морфологическое название выделенной культуры. Окраска по Граму.
Рис.5 Метод выращивания анаэробов по Фортнеру.
§ 6. Записать состав среды Плоскирева и Эндо и характер их изменений при росте различных бактерий. Произвести посев культур кишечной палочки, фекального щелочеобразователя и стафилококка на среды Плоскирева, Эндо и МПА. Для этого чашка с каждой средой делится на три сектора и на каждый сектор с помощью петли засевается одинаковое количество культуры одного из микробов (культура рассеивается по всей поверхности сектора в виде газона). При посеве на разные среды и разных микробов следует стремиться засеять одинаковое количество бактерий и одинаковым способом для того, чтобы на следующем занятии можно было сравнить интенсивность роста.
Ферментация углевода с образованием кислоты и газа обозначается буквами КГ; с образование только кислоты - буквой К. Свертывание молока и образование индола обозначается +; отсутствие ферментации углевода, свертывания молока или образования индола обозначается знаком —.
Заключение:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Рецепт среды Плоскирева___________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Рецепт среды Эндо________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Контрольные вопросы
Какие методы определения чистоты выросшей культуры Вы знаете?
Как можно по внешнему виду культуры определить ее чистоту?
В чем заключается микроскопический метод проверки чистоты выделенной культуры бактерий?
Для чего добавляется индикатор в углеводные среды "пестрого ряда"?
Результаты посева на среды “пестрого ряда”.
Виды бактерий |
Глюкоза |
Лактоза |
Манит |
Сахароза |
Молоко |
Индол |
H2S |
Подвижность |
Кишечная палочка |
|
|
|
|
|
|
|
|
Фекальный щелочеобразователь |
|
|
|
|
|
|
|
|
Что такое анаэробиоз?
Кто открыл анаэробные бактерии?
Какие методы применяются для удаления кислорода из атмосферы роста и питательных сред для анаэробов?
В чем заключается метод выращивания анаэробов, предложенный Фортнером?
Какой состав имеет среда Вильсон-Блера?
Чём отличаются облигатные анаэробы от факультативных?
Что такое регенерация питательной среды и как она производится?
Какие изменения вызывают анаэробы на среде Тароцци?
Почему происходит почернение среды Вильсон-Блера при росте анаэробов?
Как выделяют чистые культуры анаэробных бактерий?
Какой состав имеет среда Плоскирева?
Почему среда Плоскирева обладает бактериостатическим действие?
Для чего в среды Плоскирева, Эндо, Левина добавляется молочный сахар (лактоза)?
Почему колонии кишечной палочки на средах Эндо, Левина и Плоскирева окрашены?
Какие бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева вырастают в виде бесцветных колоний?
Выделение чистых культур патогенных клостридий
Исследуемый материал
Посев на плотные среды: чашка с кровяным агаром чашка с бензидиновым агаром чашка со средой Виллиса-Хоббс пробирки со средой Вильсон-Блера Инкубация в анаэробных условиях при 370 в течение 1-7 суток. |
Посев на жидкие среды для накопления (мясные, казеиновые). Инкубация при 370 в течение от 16 часов до 15 суток. Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, пересевают на плотные среды, как указано.
|
Микроскопия и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, покраснение, опалесценцию или почернение на одной из указанных сред и состоящих из грамположительных палочек, для получения чистых культур и последующего изучения их свойств.
Среда Виллиса-Хоббс : смесь (400 мл бульона Хоттингера + 4,8 грамма агара; 4,8 грамма лактозы и 1,3 мл 1% раствора нейтрального красного) автоклавируют, охлаждают до 55-50 и добавляют 15 мл суспензии яичного желтка и 60 мл стерильного обезжиренного молока.
Приложение к занятию 6.
Причины высокой чувствительности строгих анаэробов к кислороду объясняют следующими обстоятельствами:
1.Отсутствием у них каталазы (в присутствии кислорода накап ливается" перекись водорода, которая и оказывает бактерицидное действие на анаэробы).
2.В аэробных условиях тормозятся анаэробные энергетические процессы.
3.Отсутствием у анаэробов систем регуляции окислительно- восстановительного потенциала. В присутствии кислорода он повы- шается, анаэробы не могут понизить его до необходимого уровня и поэтому их рост подавляется.
Возможно, у разных видов анаэробов чувствительность к кислороду обусловлена разными механизмами.
ЗАНЯ ТИ Е 7
Дата_______________
Тема: ИНФЕКЦИЯ. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
План занятия
1. Исследование смеси бактерий. Проверка чистоты выросшей на МПА культуры (макро- и микроскопия).
2. Методы культивирования анаэробов. Регистрация результатов посева почвы. Макро- и микроскопия выросших культур.
3. Регистрация результатов опыта с посевами бактерий на среды Плоскирева, Эндо и МПА.
4. Факторы патогенности. Экзотоксины.
а)Определение экзотоксина реакцией преципитации в геле. Демонстрация.
б)Мембраноповреждающие токсины (разрушают эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, мастоциты, клетки культур тканей, протопласты и др.). Определение повреждающего действия на эритроциты (гемотоксина).
в)Определение некротоксического действия мембраноповреждающего токсина с помощью внутрикожной пробы на лабораторных животных - дермонекротическая проба. Демонстрация.
5.Факторы патогенности. Эндотоксин. Определение эндотоксина пробой на кролике. Демонстрация.
6.Факторы патогенности. Ферменты.
а)Гиалуронидаза. Определение гиалуронидазы - фактора проникновения в опыте на кролике. Демонстрация.
б)Фибринолизин. Определение фибринолизина на средах с плазмой крови. Разбор методики.
в)Плазмокоагулаза. Определение плазмокоагулазы, демонстрация опыта.
г)Лецитиназа. Определение лецитиназы на желточных средах. Демонстрация.
7.Методы заражения экспериментальных животных. Заражение белой мыши.
Методические указания.
§ I. Чистота выросшей культуры проверяется макро- и микроскопически. Вначале следует определить по внешнему виду выросшей культуры, однородный ли характер имеет микробный рост на косячке и соответствует ли его внешний вид виду исходной колонии (прозрачность, окраска, поверхность). Для определения однородности морфологии бактерии необходимо приготовить препарат-мазок и окрасить его по Граму. Результаты зарегистрировать, указав, соответствует ли макро- и микроскопически выделенная культура исходной колонии.
§ 2. Отметить изменения, наступившие на средах Тароцци и Виль-сон-Блера в результате роста анаэробов. Приготовить препараты-мазки из культур анаэробных бактерий, выросших на этих средах, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать.
§ 3. Отметить различия в характере роста кишечной палочки и фекального щелочеобразователя (размер, прозрачность и окраска колоний на средах Плоскирева и Эндо), а также интенсивность роста их и стафилококка на средах Плоскирева, Эндо и МПА. В случае роста бактерий в виде отдельных колоний подсчитать количество колоний каждого вида бактерий на всех средах. Результаты зарегистрировать в таблице .
Результаты посева на среды Плоскирева, Эндо, МПА.
Микроорганизм |
Количество колоний или степень интенсивности роста на средах | ||
Плоскирева |
Эндо |
МПА | |
Кишечная палочка |
|
|
|
Фекальный щелочеобразователь |
|
|
|
Стафилококк |
|
|
|