§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной карболовый раствором генцианвиолета и увлажняют его 2-3 каплями воды. Окрашивание продолжается 2 минуты.

Рис.1 Окраска по Граму Кишечная палочка

Рис.2 Окраска по Граму Стафилококк

Рис.3 Окраска по Граму Исследуемая культура

Сбросив пинцетом фильтровальную бумагу, на препарат наливают на 2 минуты раствор Люголя. Слив раствор Люголя, не промывая препарат, наливают на него для обесцвечивания несколько капель 96⁰ спирта на 30 секунд (обес­цвечивание должно производиться при покачивании стекла).

Быстро смыв спирт водой, препарат докрашивают раствором фук­сина Пфейффера в течение 1-2 минут, после чего промывают водой и высушивают.

Для окраски по Граму на одном стекле готовятся три мазка из разных культур (для контроля). Мазок в середине стекла готовят из изучаемой культуры, а по концам стекла с одной стороны - из куль­туры стафилококка (заведомо грамположительная); а с другой - из культуры кишечной палочки (заведомо отрицательная).

Приготовленный таким образом тройной препарат-мазок подсуши­вают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают как один мазок, чтобы соблюсти одинаковые условия. Лишь при правиль­ной окраске контролей (темно-фиолетовый стафилококк и розовая кишечная палочка) можно считать правильной и окраску среднего мазка, то есть изучаемой культуры.

Из исследуемой культуры приготовить два препарата и окрасить по Граму, один с контролями, а другой без них, промикроскопировать и зарисовать их.

§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.

Фиксированный мазок окрашивают заранее приготовленной уксуснокислой синькой Нейссера 5 минут. Промывают препарат водой и обра­батывают его раствором Люголя в течение I минуты. Не промывая водой, докрашивают препарат везувином 15 секунд. Затем промывают, высу­шивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а тело бактерий - в соломенно-желтый цвет.

§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.

На предметное стекло нанести каплю туши, внести в нее неболь­шое количество исследуемой культуры с помощью бактериальной петли, тщательно перемешать. Ребром второго предметного стекла сделать мазок, как для исследования крови. Высушить мазок на воздухе и зафиксировать на пламени спиртовки. Нанести на мазок несколько капель водного фуксина на 2-3 минуты, затем промыть, высушить и промикроскопировать. На фоне туши четко видны окрашенные фуксином бактериальные клетки, окруженные светлым овалом (капсулы). Зарисовать препарат.

§ 6. В препарате "раздавленная капля" споры, обладающие более высоким коэффициентом преломления, выглядят в виде блестящих или темных (в зависимости от Фокусировки объектива) образований, отличающихся от более тусклых и неясно очерченных тел бактерий.

При окраске фуксином Пфейффера споры не окрашены и выглядят в виде бесцветных овальных образований, расположенных внутри окрашенных клеток или свободно лежащих между клетками.

Для окраски препарата по способу Клейна фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на бумагу налива­ют карболовый фуксин Циля и подогревают препарат над спиртовкой до появления паров 4-5 раз. Пинцетом снимают бумажку и обесцвечивают препарат, погружая его в стаканчик с 1% -ным раствором серной кислоты на 5-6 секунд. Тщательно промывают препарат и дополни­тельно докрашивают метиленовым синим 3-5 минут. Промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки - в синий. Всё приготовленные препараты зарисовать.

§ 7. Демонстрация электронограмм ультратонких срезов различных видов бактерии. Определить на электронограммах клеточную стен­ку, цитоплазматическую мембрану, мезосомы, рибосомы и нуклеоид (ядерную вакуоль).

Рис.4 Зерна волютина;окраска по Нейссеру

Рис.5 Капсулы у бактерий; окраска по методу Бури-Гинса. Klebsiella pneumoniae

Рис.6 Споры бактерий; окраска фуксином

Рис.7 Споры бактерий; окраска по Клейну

Рис.8 Споры бактерий; “раздавленная капля”

Контрольный вопросы.

Какие красители - кислые или основные - чаще применяются при окрашивании бактерий и почему?

Какие основные красители красного, синего, фиолетового и ко­ричневого цвета применяются в микробиологии?

Как готовится концентрированный карболовый раствор основного фуксина и насыщенный раствор метиленового синего?

Какие способы окрашивания микробов Вы знаете?

Из каких последовательных этапов складывается приготовление препарата-мазка?

Для чего необходима фиксация препарата-мазка?

Какие способы фиксации препаратов Вы знаете?

Как производится фиксация на пламени и как контролируется ее качество?

Как определить, на какой стороне стекла находится мазок?

В чем заключается принцип окраски по Граму?

В какой цвет окрашены грамположительные бактерии и почему?

Какова методика окраски по Граму?

Как контролируется правильность окраски по Граму?

Почему зерна волютина окрашенные метиленовым синим, получили название метахроматических?

Какие образования составляют оболочку бактерий?

Что представляют собой цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка и капсула?

Какие включения могут быть в цитоплазме бактерий?

Какую роль играют капсулы у патогенных бактерий?

По каким признакам можно заподозрить наличие капсул в микроб­ной культуре?

Что такое споры бактерий, каковы их свойства?

Как можно заподозрить наличие опор в микробной культуре?

Каковы принципы окраски капсул у бактерии?

Каковы принципы окрашивания спор у бактерий?

С чем связана высокая терморезистентность спор?

Какова структура пептидогликана?

Каковы функции клеточной стенки бактерий?

Каковы функции цитоплазматической мембраны?

Что такое рибосомы?

Чем отличается ядерный аппарат бактерий от ядерного аппарата эукариотов?

Приложение к занятию 3

В микробиологической практике наиболее часто используются слдующие анилиновые красители: I) красные (фуксин основной, фуксин кислый, сафранин, нейтральный красный, конгорот); 2) синие (мети-леновки и толуидиновый синие и др.); 3) фиолетовые (генциан фиоле­товый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый); 4) желто-коричневые (везувин, хризоидин); 5) зеленые (бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый).

Из перечисленных анилиновых красителей готовят основные насыщенные спиртовые растворы, которые могут храниться довольно продолжительно. Для приготовления рабочих растворов основной насыщенный спиртовый раствор красителя разводят дистиллированной водой в соот­ношении 1:10.

Карболовый фуксин Циля

Основной фуксин 1 г

Спирт 96⁰ 10 мл

Карболовая кислота кристаллическая 5 г Глицерин несколько капель

Вода дистиллированная до 100 мл

Водный фуксин (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля 1 мл

Дистиллированная вода 10 мл

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего

Метиленовый синий 10 г

Спирт 96⁰ до 100 мл

Водно-спиртовый раствор метиленового синего

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего 10 мл

Дистиллированная вода 100 мл

Метиленовый щелочной синий Лёффлера

Насыщенный спиртовый раствор метиленового синего 30 мл

Едкий натр или едкое кали 1%-ный раствор I мл

Дистиллированная вода до 100 мл

ЗАНЯТИЕ 4

Дата_________________

Тема: МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛ0ГИЯ СПИРОХЕТ. АКТИНОМИЦЕТОВ, ГРИБОВ И ПРОСТЕЙШИХ.

План занятия

1.Спирохеты возвратного тифа. Микроскопия готовых препаратов.

2.Бледная спирохета. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из чистой культуры бледной спирохеты.

3.Лептоспиры. Демонстрация живой культуры в темном поле.

4.Актиномицеты: а) приготовление, окраска и микроскопия пре­парата-мазка из чистой культуры актиномицета; друза актиномицета демонстрация готового препарата.

5.Нитчатые грибы. Макроскопия культур и микроскопия препара­тов "раздавленная капля".

6.Дрожжевые грибы. Приготовление и микроскопия окрашенных препаратов-мазков.

7.Дрожжеподобные грибы рода кандида. Макро- и микроскопия культур грибов кандида.

8.Простейшие:

а)микроскопия трипаносом, окрашенных по Романовскому;

б)микроскопия препаратов лейшманий из тканей больного и из чистой культуры.

9.Малярийный плазмодий. Микроскопия препаратов из крови больных малярией: изучение различных форм развития плазмодия маля­рии.

10.Токсоплазмы. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из органов зараженной токсоплазмами белой мыши.

11.Амебы. Микроскопия готовых препаратов.

Методические указания