Часть III

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

ЗАНЯТИЕ 1

Дата______________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КОККОВЫХ

ИНФЕКЦИИ.

План занятия

1. Изучение морфологии и культуральных свойств стафилококков.

2. Изучение морфологии и культуральных свойств стрептококков.

3. Бактериологическое исследование гноя: микроскопия и посев та кровяной агар.

4. Исследование флоры зева. Микроскопия и посев на кровяной агар.

5. Бактериологическое исследование крови. Посев крови на са­харный МПБ (демонстрация).

Методические указания

§ I. Обратить внимание на внешний вид культур стафилококков мутность, осадок в МПБ; характер налета, степень прозрачности и наличие пигмента на МПА. Приготовить и окрасить по Граму препараты всех видов стафилококков, выросших на плотных и жидких питательных средах. Препараты зарисовать.

§ 2. Обратить внимание на внешний вид культур стрептококков на жидких и плотных средах - придонно-пристеночный рост на сахарном бульоне, величину колоний и наличие зоны гемолиза или позеленения на кровяном МПА. Приготовить и окрасить по Граму препараты-мазки из культур гемолитического и зеленящего стрептококков с кровяного МПА и сахарного МПБ. Сравнить морфологию одного и того же вида стрептококка, выращенного на жидких и плотных питательных средах. Препараты зарисовать.

§ 3. Приготовить из гноя препарат-мазок и окрасить его по Граму. Обратить внимание на взаиморасположение кокков в препаратах-мазках из гноя. Препарат зарисовать. Произвести посев гноя петлей штриховым способом на половину чашки с кровяным или молочно-желточно-солевым МПА.

§ 4. Взять материал со слизистой зева друг у друга стерильным ватным тампоном. Для приготовления мазка материал с тампона растереть на поверхности предметного стекла, предварительно прокаленного и остуженного (стекло должно быть стерильным, чтобы не загрязнить тампон). После приготовления мазка тем же тампоном произвести посев на половину чашки с кровяным МПА. Приготовленный мазок зафиксировать, окрасить по Граму и промикроскопировать. Обратить внимание на наличие в мазке кокков и характер их взаиморасположения.

Рис.1 Золотистый стафилококк на МПА

Рис.2 Золотистый стафилококк на МПБ

Контрольные вопросы

Чем отличается морфология стафилококков на плотных и жидких питательных средах?

Каков характер роста стафилококков на жидких и плотных питательных средах?

Рис.3 Эпидермальный стафилококк на МПА

Рис.4 Эпидермальный стафилококк на МПБ

Рис.5 Гемолитический стрептококк на кровяном МПА

Рис.6 Гемолитический стрептококк на сахарном МПБ

Рис.7 Зеленящий стрептококк на кровяном МПА

Рис.8 Зеленящий стрептококк на сахарном МПБ

Рис.9 Мазок из гноя

Рис.10 Мазок из зева

Какова классификация стафилококков?

Какие заболевания вызывают стафилококки?

Какой материал берут от больных при различных стафилококк; заболеваниях и как его доставляют в лабораторию?

Какие микробиологические методы используют для диагностики заболеваний, вызываемых гноеродными кокками?

Как производят бактериологическое исследование гноя при стафилококковых заболеваниях?

Как производят выделение гемокультуры при стафилококковом сепсисе?

Какова морфология стрептококков? Чем отличается их морфология на жидких и плотных питательных средах?

Какова классификация стрептококков по характеру роста на кровяном МПА?

Каково антигенное строение стрептококков?

Какие серологические классификации стрептококков существуют и на чем они основаны?

Как производят определение групп и типов стрептококков?

Какие заболевания вызывают стрептококки?

Какой материал берут от больных при различных стрептококковых заболеваниях и как его доставляют в лабораторию?

Как производят бактериологическое исследование при различных стрептококковых заболеваниях?

Какие питательные среда применяются для выращивания стрептококков?

Каковы особенности роста стрептококков на жидких и плотных питательных средах?

Какое значение имеет определение титров анти-0-стрептолизина и антигиалуронидазы?

Каковы отличительные признаки энтерококков?

Какое значение имеет М-антиген стрептококков?

Методы микробиологической диагностики стафилококковых и стрептококковых инфекций

А. Бактериологический

Рис.11 СХЕМА

Материал из зева, носа,отделяемое ран,кровь,гнои

Б. Серологический

1. Определение анти-0-стрептолизина.

2. Определение антигиалуронидазы.

Приложение к занятию I

А. Критерии патогенности стафилококков

Критерии	Безусловно патогенные стафилококки	Условно патoгeиные стафилококки	Непатогенные стафилококки
1.Гемолитические свойства	Резкий гемолиз на агаре с 5 % крови кролика или барана	Незначительный гемолиз	Гемолиза нет
2.Некротические сойства	Некроз при внутрикожном введении кролику	При внутрикожном введении воспаление (некроза нет)	Внутрикожная проба отрицательна
3.Плазмокоагулирующие свойства	Свертывание плазмы через 1-2 часа	Свертывание плазмы через 6 часов и позднее	Свертывание плазмы не происходит
4.Цвет пигмента

Б. Классификация рода Staphylococcus

1. Коагулозоположительные стафилококки

Виды

1.S.aureusxxx

2.S.intermediusхх

2. Коагулазоотрицательные стафилококки

3. S.saprophyticusx l0.S.xylosis 17.S.gallinarum.

4. S.hominisx 11.S.sciuri 18.S.kloosii

5. S.capitis 12.S.simulans 19.S.auricularis

6. S.warneri 13.S.hyicusx 20.S.caprae

7. S.epidermidisxxx 14.S.arlettae 2l. S.eqorum

8. S.haemolyticusx 15.S.carnosus 22. S.lentus

9. S.cohnii 16.S.caseolyticus 23. S.saccharolyticus

Примечание: х - патогенные только для человека хх - патогенные только для животных ххх- виды, патогенные для человека и животных

В. Экзотоксины, продуцируемые токсигенными стафилококками

Тип токсина	Действие токсина
1.Мембраноповреждающие α,β,γ,δ	Разрушают различные клетки (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, макрофаги, мастоциты, клетки культур тканей, протопласты и др.)
2.Лейкоцидин P-V	Разрушает лейкоциты
3.Энтеротоксины А,В,С1,С2,СЗ,Д,Е	Вызывают пищевые интоксикации
4.Эксфолиативные А и В	Вызывают отслоение эпидермиса (пузырчатка новорожденных)
5.Экзотоксин токсического шока (ЭТШ)	Вызывает синдром токсического шока

Г. Основные межвидовые различия у микробов рода Staphylococcus

Признак	Вид
	S.aureus	S.epideimidis	S.saprophyticus
Наличие: плазмокоагулазы	+	—	—
фосртазы	+	+	—
аргининдигидролазы	+	+	—
нитратредуктазы	+	+	—
Окисление: маннита	+	—	+
трегалозы	+	—	+
галактозы	+	+	—
маннозы	+	+	—
рибозы	+	—	—
Устойчивость к: новобиоцину	—	—	+
лизостафину	—	+	+

Д. Основные дифференциальные признаки стрептококков группы А и стрептококков группы D (энтерококки)

Признаки	Стрептококки
	Группа А	Группа D (энтерококки)
1.Форма	круглая	Чаще овальная
2.Взаиморасположение	цепочки	Парами, короткие цепочки
3.Температурные пределы роста	25-380	10-450
4.Рост на средах с рН 9,6	—	+
5.Pост на средах, содержащих 6,5% NaCl	—	+
6.Рост на среде с 40% желчи	—	+
7.Рост на молоке, содержащем 0,1% метиленового синего	—	+
8.Гиалуронидазная активность	+	—
9.Терморезиствнтность (при 60° в течение 30 мин.)	—	+

ЗАНЯТИЕ 2

Дата________________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КОККОВЫХ ИНФЕКЩЙ

(продолжение)

План занятия

1. Бактериологическое исследование гноя (продолжение). Макро- и микроскопия колоний, выросших при посеве гноя.

2. Определение патогенности стафилококка. Обнаружение плазмокоагулазы, токсина - гемолиз (демонстрация). Фаготипирование стафилококков (демонстрация). Определение чувствительности культуры к антибиотикам.

3. Исследование флоры зева. Макро- и микроскопия колоний, выросших на кровяном МПА.

4. Изучение морфологических и культуральных свойств пневмококка (демонстрация).

5. Менингококк. Демонстрация готовых препаратов-мазков.

6. Гонококк. Микроскопия мазков из гноя больного гонореей.

7. Демонстрация лечебно-профилактических и диагностических препаратов, применяемых при кокковых инфекциях (вакцины, анатоксины, антибиотики, фаги).

Методические указания

§ I. На чашках с посевами найти колонии стафилококка: небольшие, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, с гладкой и блестящей поверхностью. Обратить внимание на наличие пигмента на молочном МПА и гемолиза на кровяном МПА. Промикроскопировать мазок из колонии и зарисовать в тетрадь.

§ 2. Для определения чувствительности стафилококка к антибиотикам взять петлей колонию, размешать ее в пробирке с МПБ, чтобы получилось заметное помутнение бульона. 2-3 капли полученной эмульсии нанести в центр чашки с МПА и тщательно растереть по всей поверхности агара. Разделить дно чашки с тыльной стороны карандашом на 4 сектора, надписать на секторах названия антибиотиков и положить в центр каждого сектора прокаленным и остуженным пинцетом диск с соответствующим антибиотиком.

§ 3. Просмотреть чашки с посевами материала из зева. Обратить внимание на наличие мелкоточечных колоний с зоной гемолиза или позеленения. Промикроскопировать и зарисовать препарат, приготовленный из подозрительной колонии (окраска по Граму).

§ 6. Готовые препараты-мазки из отделяемого уретры больного гонореей окрасить метиленовым синим или по Граму. При микроскопии необходимо отыскать в препарате лейкоцит с заключенными в нем диплококками, имеющими форму кофейного зерна.

Рис.1 Микроскопия колонии из посева гноя

Рис.2 Микроскопия колонии из посева слизи

Рис.3 Пневмококк

Рис.4 Менингококк

Ри.5 Окраска по Граму Гонококк в отделяемом уретры больного гонореей.

Рис.6 Окраска метиленовым синим. Гонококк в отделяемом уретры больного гонореей.

Методы микробиологической диагностики гонококковых инфекций

А. Бактериоскопический

Материал: гной из мочеполовых органов, с конъюнктивы глаза

Рис.7 СХЕМА

Контрольные вопросы

По каким признакам определяют патогенность выделенной культуры стафилококка?

Как определяют наличие у стафилококка плазмокоагулазы?

Какие токсины образует стафилококк и как они обнаруживаются?

Каким образом решается вопрос о выборе антибиотиков для лечения заболеваний, вызванных стафилококками?

Как и с какой целью осуществляют фаготипирование стафилококков?

Какова морфология, тинкториальные и культурные свойства гонококков и менингококков?

В чем отличие их биохимических свойств?

Какие заболевания вызывает менингококк, какой материал берется при разных формах менингококковых заболеваний и как он исследуется?

Как осуществляют микроскопическую диагностику гонореи? На основании каких признаков делается заключение об обнаружении гонококков в микропрепарате из гнойного отделяемого?

Как осуществляют бактериологическую и серологическую диагностику гонококковых заболеваний?

Каковы морфология, культуральные и биохимические свойства пневмококков? На основании каких свойств можно отличить пневмококки от стрептококков? Каково антигенное строение пневмококков, как они классифицируются?

Какие заболевания вызывают пневмококки? Какой материал используется для диагностики этих заболеваний и как производится выделение возбудителя?

Как осуществляют выделение пневмококка биологическим методом и в чем

преимущество этого метода?

Какие бактериальные препараты применяют для лечения и профилактики инфекций, вызываемых патогенными кокками?

Каковы принципы приготовления и применения лечебных аутовакцин? При каких заболеваниях они могут быть использованы?

Приложение к занятию 2

Фаготипирование стафилококков

Для типирования патогенных плазмокоагулирующих стафилококков используют международный набор из 23 умеренных бактериофагов. Эти фаги разделены на группы:

1.группа - фаги 29,52,52А,79,80;

2.группа - фаги ЗА,ЗС,55.71;

3.группа - фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85;

4.группа - фаги 94 ,95 ,96; и вне групп фаг 81.

Перед работой набор сухих фагов стерильно растворяют в щелочном бульоне (рН-7,6) с 0,4% глюкозы и 0,02% CaCl₂ . В ампулу добав­ляют I мл бульона и получают разведение фага 10^-1. Из этого основно­го разведения готовят два рабочих разведения, соответствующие тест-разведению (ТР) и 100 ТР. Разведение, соответствующее 1 ТР, указано на этикетке фага.

Степень лизиса культуры разными разведениями фага регистрирует­ся по следущей схеме:

++++ сливной, полный лизис,

+++ полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса),

++ наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага (пятен лизиса),

+ от 20 до 50 колоний фага,

— полное отсутствие лизиса.

Наивысшее разведение, вызвавшее лизис эталонного штамма на +++, называется тест разведением (I TP) фага.. Например, если на этикетке указано, что I ТР данной серии фага 10^-3, то для получения I TP на­до из разведения 10^-1 сделать два последовательных десятикратных раз­ведения, и разведение 10^-3 будет соответствовать I ТР.

Методике фаготипирования

Суточную агаровую культуру стафилококка засевают в 2,5 мл бульо­на Хоттингера, Мартена или МПБ (рН 7,2-7,4) и выращивают 3-4 часа при 37° (до появления заметной мути).

Одновременно готовят чашки с 1,2% агаром, приготовленным на бульоне Хоттингера с добавлением свежей мясной вода (рН 7,6; глюко­зы 0,4%). CaCl₂ добавляют в расплавленный агар непосредственно перед разливом (0,2 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl₂ на, 100 мл агара). По 25-30 мл расплавленного агара разливают в чашки Петри и после застывания подсушивают чашку 30-40 минут при 37° . Затем 3-4-часовую испытуемую культуру стафилококка пастеровской пипеткой за­севают газоном, избыток культуры удаляют пипеткой, а чашку подсуши­вают 30-40 минут.

Дно засеянной чашки расчерчивают карандашом на 23 квадрата и в каждый квадрат засеянной среды стандартной петлей (диаметр 2 мм) или тонко оттянутой пипеткой наносят каплю соответствующего фага всегда в одном и том же порядке.

После подсыхания фага чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30⁰ или 5-6 часов при 37⁰ и оставляют до следующего утра при комнатной температуре.

Фаготипирование начинают рабочим разведением фагов, соответст­вующим I ТР. Шгаммы, с которыми получен отрицательный результат, на следующий день типируют повторно, используя разведения фагов, соответствующие 100 ТР (разведение 1:10) в нашем опыте .

Учет и регистрация результатов Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал силь­ную реакцию при типировании I ТР или 100 ТР. (Продолжение см.стр.138)

Б. Бактериологический.

Материал: гной из мочеполовых органов, конъюктивы глаза, синовиальная жидкость, кровь.

Рис. 8 СХЕМА

В. Серологический – РСК

Методы микробиологической диагностики менингококковых инфекций.

А. Бактериоскопический

Б. Бактериологический

Материал: спинномозговая жидкость, кровь, экссудат, гной, слизь из зева и носоглотки

Рис. 9 СХЕМА

В. Иммунологический метод диагностики менингококковых заболеваний

Для диагностики менингококковых инфекций помимо классического бактериологического способа используют также различные серологиче­ские реакции, позволяющие обнаружить антигены возбудителя в спинно­мозговой жидкости и в крови. С этой целью применяют реакции коагглютинации, латекс-агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, реакцию пассивной гемагглютинации и эритроиммуноадсорбцию. Последний метод предложен, в частности, для обнаружения полисахаридного антигена серогруппы А (наиболее частого возбудителя менингита). Суть метода за­ключается в том, что луночки полистиролового планшета сенси­билизируют противоменингококковыми антителами, затем в них добав­ляют исследуемый материал, содержащий искомый антиген. Смесь инкубируют при 37⁰ в течение 30-60 мин для связывания антигена антителами. После отмывания в луночки добавляют эритроцитарный диагностикум (эритроциты, несущие антитела к менингококку группы А). В качестве положительного контроля в одну из луночек добавляют полисахарид группы А, отрицательного - эритроциты без антител. Реакцию учитыва­ют через 20 мин седиментации при 22⁰ визуально и оценивают по 4-х крестной системе. В случае положительной реакции комплекс антитело-антиген взаимодействует с сенсибилизированными эритроцитами, в ре­зультате образуется гомогенный слой эритроцитов, фиксированных на стенках луночек. При отрицательной реакции эритроциты скатываются на дно, образуя компактный осадок.

Методы микробиологической диагностики пневмококковых инфекций.

А. Бактериологический

Материал: мокрота, кровь, гной, экссудат, отделяемое носоглотки, спинномозговая жидкость. Рис.10 СХЕМА

Б. Биологический

Рис.11 Схема

Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную для него фагомозаику. В зависимости от фагов, входящих в эту мозаику, штамм стафилокок­ка относят к тем или иным фагогруппам.

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

Метод дисков

Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, поме­щают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, По­севы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам. Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на вы­сокую чувствительность. Более точные результаты получают при исполь­зовании метода серийных разведений.

Метод серийных разведений

Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дис­тиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворе­ния добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном раст­воре соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержа­щий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентра­цию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельству­ет о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предваритель­ные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

По истечении необходимого срока инкубации определяют максималь­ное разведение антибиотика, которое еще подавляет рост культуры. Концентрация антибиотика в последней пробирке с видимой задержкой роста и представляет собой минимальную задерживающую концентрацию антибиотика (МЗК).

Штамм считается чувствительным к антибиотикам, если МЗК препа­рата для данного штамма соответствует концентрации этого препарата, создаваемой в организме.

ЗАНЯТИЕ 3

Дата__________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

(окончание).

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЩЙ (бруцеллез).

План занятия

А. Микробиологический диагноз кок­ковых инфекций (окончание).

I. Регистрация результатов определения чувствительности стафи­лококков к антибиотикам. .

Б. Микробиологический диагноз особо опасных инфекций (бруцеллез).

1.Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл.

2.Бактериологическая диагностика бруцеллеза. Выделение гемокультуры (разбор).

3.Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта.

4.Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза -реакция Хеддлъсона и др.

5.Опсоно-фагоцитарная реакция.

6.Аллергическая диагностика бруцеллеза.Постановка пробы Бюрне.

7.Демонстрация препаратов, применяемых для диагностики, профилактики и лечения бруцеллеза (диагностикум, бруцеллин, профилактическая и лечебная вакцины).

Методические указания

А. Микробиологический диагноз кок­ковых инфекций (окончание):

§ 1. Измерить и записать в таблицу диаметр зоны задержки роста стафилококка каждым антибиотиком. Сформулировать и записать вывод о степени чувствительности выделенной культуры к различным антибиоти­кам.

Б. Микробиологический диагноз осо­бо опасных инфекций (бруцеллез).

§ 1. Приготовить, окрасить по Граму и промикроскопировать пре­парат из убитой культуры бруцелл. Обратить внимание на размеры микроорганизмов.

§ 3. Поставить реакцию Райта с сывороткой больного бруцеллезом по классической схеме пробирочной реакции агглютинации (см. Часть I, занятие 10-е). Диагностический титр реакции Райта - 1:200.

§ 4. На стекле размечают карандашом 4 квадрата размером 3x3 см каждый. Микропипеткой наносят в квадраты капли сыворотки объемом 0,04, 0,02 и 0,01 мл,в последний квадрат одну каплю (0,03 мл) физиологического раствора (контроль) . В каждую каплю другой микропипет­кой добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума. Перемешивают капли стеклянной палочкой пли петлей, начиная с контрольной капли и идя от меньших количеств сыворотки к большим. Слегка подогревая и покачивая стекло, наблюдают за появлением агглютинации, которая должна наступать в течение 5 минут.

Оценке реакции: агглютинация только в первой капле - реакция сомнительная; агглютинация в первой и второй каплях - реакция положительная; агглютинация во всех трех каплях - реакция резко положи­тельная.

Примечание: Реакция Хеддльсона имеет только ориентировочное значение. В случае ее положительного результата необходимо ставить реакцию Райта и аллергическую пробу Бюрне.

Зарисовать реакцию Хеддльсона с указанием доз сыворотки в каждой капле.

§ 6. Реакция Бюрне. Техника постановки реакции:

а) стерильным тампоном, смоченным спиртом, тщательно дезинфицируют кожу на границе верхней и средней трети передней поверхности предпдечъя;

б) в шприц с делениями по 0,1 мл и о тонкой иглой набирают бруцеллин (обратить внимание на внешний вид, данные этикетки и срок годности препарата!) ;

в) держа шприц по возможности параллельно поверхности кожи, вводят иглу внутрикожно. Для этого необходимо держать иглу срезом вверх и толчкообразными движениями насаживать на нее кожу. Когда срез иглы скроется в коже, иглу поворачивают срезом вниз и, осторожно нажимая на поршень, вводят содержимое шприца в кожу (0,1 мл бруцеллина). На месте инъекции должен образоваться небольшой белый волдырь, указывающий на правильное введение препарата;

г) реакцию учитывают дважды: через 24 и 48 часов. В случае положительной реакции (наличие отека и гиперемии) миллиметровой линейкой измеряют размер отека (длина и ширина).

Регистрация чувствительности к антибиотикам выделенной культуры стафилококка.

Антибиотик	Пенициллин	Стрептомицин	Левомицетин	Тетрациклин
Диаметр зоны задержки роста (в миллиметрах)

Вывод:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рис.1 Бруцеллы Окраска по Граму.

Реакция Хеддльсона

Номер капли	1	2	3	4
Доза сыворотки
Результат

Заключение________________________________________________________________________________________________________________________________________

Контрольные вопросы

Какие виды бруцелл вызывают бруцеллез у человека?

Каковы основные хозяева бруцелл соответствующих видов?

Каковы морфология и культуральные свойства различных видов бруцелл?

Какие свойства бруцелл используются для классификации их на вида и биотипы?

Какой из видов бруцелл наиболее патогенен для человека?

Каковы пути заражения бруцеллезом?

Какие микробиологические методы применяются для диагностики бруцеллеза?

Какой берется от больного материал для выделения возбудителя бруцеллеза? Как осуществляется выделение возбудителя из разного ма­териала?

Какими методами осуществляется серологическая диагностика бру­целлеза? Какова техника постановки серологических реакций?

Каково диагностическое значение реакции Хеддльсона?

Как производится оценка реакции Райта? Какова ее диагностиче­ская ценность?

Как производится опсоно-фагоцитарная реакция?

Как ставится аллергическая проба Бюрне? Через сколько времени и как производится ее оценка?

С какого дня заболевания рекомендуется ставить реакцию Райта и пробу Бюрне?

Что такое бруцеллин и как его получают?

Как производится специфическая профилактика бруцеллеза? Как производится отбор лиц, подлежащих специфической вакцинации?

Какие категории работников подвергаются специфической профи­лактике в первую очередь?

В чем заключается принцип вакцинотерапии бруцеллеза?

Какова методика постановки реакции Кумбса? (см. Часть I, заня­тие 12).

Методы микробиологической диагностики бруцеллеза.

А. Бактериологический

Рис.2 СХЕМА

Б. Биологический

Рис.3 СХЕМА

В. Серологический

Для диагностики бруцеллеза используются следующие серологические реакции:

А. Для обнаружения антител

1.Реакция Райта (титр антител определяют в международных единицах - МЕ. Диагностическое значение имеет титр антител более 200 МЕ/мл.

2.Реакция Кумбса (для определения неполных антител).

3.Ускоренные реакции: Хеддльсона, роз-бенгал, латекс-агглютинация, непрямая реакция гемолиза (эритроциты сенсибилизируют липо-полисахаридом бруцелл, добавляют сыворотку больного. Антиген соединяется с антителом и в присутствии комплемента происходит лизис эритроцитов), реакция иммунофлуоресценции (непрямой метод на предметном стекле).

4.Реакция пассивной гемагглютинации.

5.Иммуноферментный метод (лунки сенсибилизируют антигеном).

6.Реакция связывания комплемента.

7.Опсоно-фагоцитарная реакция (ОФР).

Б. Для обнаружения антигена

1.Реакция агрегат-гемагглютинации.

2.Иммуноферментный метод (луночки сенсибилизируют антителами к родоспецифическому антигену бруцелл).

3.РПГА с использованием эритроцитарного диагностикума с моноклональными антителами к родоспецифическому антигену бруцелл).

4.Реакция коагглютинации.

Кроме того, для быстрой диагностики бруцеллеза разработан метод ДНК/ДНК гибридизации.

Г. Аллергический - проба Бюрне

Приложение к занятию 3.

Дифференциальная характеристика видов рода Brucella.

Вид	Количество биоваров	Потребность в CO2	Бактериостатическое действие красителей			Активность уреазы	Выделение сероводорода	Агглютинация сыворотками		Отношение к тбилисскому фагу
			Фуксин 1:50000	Тионин 1:25000	Сафранин 1:20000			Антиабортус	Антимелитензис
B. melitensis	3	—	+	+	+	++ (2 час)	—	—	+	—
B. abortus	9	+	+	—	+	+(18-20час)	±	+	—	+
B. suis	5	—	—	+	—	+++(15-20мин)	++	+	+	—
B. rangiferis	1	—	—	+	—	+++ (8-13мин)	—	—	—	—
B. neotomae	1	—	—	—	—		+	+	—
B. ovis	1	+	+	+			—	—	—
B. canis	1	—	—	+			—	—	—

Обозначения: + - наличие роста, выделение уреазы, сероводорода,

агглютинабельность сыворотками, лизис фагом;

— - отсутствие роста, выделения уреазы, сероводорода, агглютинабельности сыворотками, лизиса фагом.

ЗАНЯТИЕ 4

Дата____________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ОСОБООПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ (бруцеллез, чума, туляремия, сибирская язва)

План занятия

1. Регистрация результатов реакции Райта.

2. Возбудитель чумы. Морфология - демонстрация готовых препаратов-мазков.

3. Микробиологическая диагностика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. См.приложение.

4. Возбудитель туляремии. Морфология - микроскопия готовых препаратов-мазков из чистой культуры и из органов зараженных животных.

5. Возбудитель сибирской язвы. Изучение морфологических и культуральных свойств. Приготовление и микроскопия мазков из чистой куль­туры авирулентной сибиреязвенной палочки.

6. Правила взятия материала, пересылки в лабораторию и условия

работы с возбудителями особо опасных инфекций.

7.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагности­ки, профилактики и лечения чумы, туляремии, бруцеллеза и сибирской язвы (диагностикумы, аллергены, вакцины, сыворотки).

Методические указания