- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
1.Вирусоскопический - обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптических микроскопов внутриклеточных включений.
2.Обнаружение вирусов с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.
3.Вирусологические методы - выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.
4.Серологические методы - обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, реакций иммуноферментного метода (ИФМ), радиоиммунного метода, (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах),реакций преципитации в агаре, имлунофлуоресцентного метода. В принципе эти реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных антигенов.
5.Биологические методы - заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.
ЗАНЯТИЕ 2
Дата________________
Тема: МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ (окончание).
План занятия
1.Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):
а)изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;
б)выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);
в)обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы (демонстрация;
г)выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстра ция);
д)обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.
2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):
а)вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение измененийв них;
б)постановка реакции гемагглютинации;
в)определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Методические указания
§ I а)Цитопатическии эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие, выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.
Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.
б)Гемадсорбция - адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.
Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.
Зарисовать картину гемадсорбции.
в)Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изменение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 - оранжевый и при рН ниже 7 - желтый.
Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.
Метод цветных проб может быть использован для титрования вируса или вируснейтрализирующих антител.
Цветные пробы зарисовать.
г)Метод бляшек предложен Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.
Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражаю вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.
Феномен бляшкообразования зарисовать.
Метод флуоресцирующих антител основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 40 в течение 10 минут. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 минут при 370. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.
§2. Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях, Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную оболочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.
Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют все содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологическим раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.
Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 минут.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа вируса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или антител (антигемагглютининов).
Рис.1.Культура клеток, зараженная вирусом осповакцины (цитопатический эффект)
Рис.2 Реакция гемадсорбции. Окраска по Романовскому.
Рис.3 Реакция гемагглютинации 1-опыт; 2-контроль.
К капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, прибавляют каплю 5%-ной взвеси куриных эритроцитов.
Рис.4 Метод цветных проб 1-Культура ткани, не зараженная вирусом; 2-Культура ткани, зараженная вирусом.
Рис.5 Культура ткани, зараженная вирусом полиомиелита (феномен бляшкообразования)
Рис.6 Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.
В капле вируссодержащей жидкости прибавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. К-контроль(эритроциты+физиологический раствор).
Контрольные вопросы
Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?
Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?
С какой целью может быть использован метод цветных проб?
Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?
Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?
Что собой представляет метод бляшек?
Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?
Как вскрывают зараженный эмбрион?
Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутствии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?
Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?
Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вызванные вирусом?
Приложение к занятию 2
Классификация цитопатического действия (ЦПД) вирусов в культуре ткани.
1.Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (вирусы Кок-ЕСНО, полиовирусы).
2.Очаговая мелкозернистая дегенерация (вирусы гриппа, клещевого энцефалита и др.).
2.Гроздевидная дегенерация (аденовирусы).
3.Крупнозернистая равномерная деструкция (вирус герпеса).
4.Симпластообразование (обезьяньи вирусы, вирусы кори, осповакцины, RS-вирус).
Методы обнаружения вируса в культуре ткани
1.Цитопатический эффект.
2.Реакция гемадсорбции.
3.Метод цветных проб.
4.Метод бляшек.
5.Иммунофлуоресцентный метод.
6.Реакция связывания комплемента.
7.Реакция гемагглютинации.
8.Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.
9.Реакция преципитации в агаре.
Методы определения типа вирусов (типирование вирусов)
Определение типа вирусов в вирусосодержащем материале основано на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:
1)нейтрализация ЦПД;
2)нейтрализация реакции гемадсорбции;
3)цветная проба;
4)задержка (торможение) гемагглютинации;
5)свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифиаческих флуоресцирующих сывороток;
6)нейтрализация в опыте на животных.