- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
§ 3. На хорошо обезжиренное покровное стекло нанести петлей небольшую каплю водопроводной воды, с помощью бактериологической петли внести в нее незначительное количество исследуемой культуры ("облачко помутнения") и размешать ее, не размазывая капли.
Взять предметное стекло с углублением и края углубления смазать тонким слоем вазелина. Перевернув предметное стекло углублением вниз, наложить его на покровное стекло так, чтобы капля соответствовала средине углубления, и слегка прижать одно стекло к другому. Быстро перевернуть полученную влажную камеру покровным стеклом вверх и с помощью рукоятки петли прижать края покровного стекла, чтобы получить герметически замкнутую камеру. Капля должна висеть в камере, не сливаясь с ее дном.
Помещают препарат "висячая капля" на предметный столик микроскопа покровным стеклом вверх. Опустив конденсор, устанавливают слабый объектив и отыскивают край капли. Устанавливают край капли точно в центре поля зрения и закрепляют препарат клеммами.
Приподняв тубус, поворотом револьвера ставят сильный сухой объектив (40Х). Глядя сбоку, опускают объектив на расстояние, меньшее свободного рабочего (почти вплотную к покровному стеклу). Глядя в окуляр и уменьшив освещение диафрагмированием или опусканием конденсора, с помощью макровинта медленно поднимают тубус до тех пор, пока не удастся увидеть край капли. Если с первого раза это
Рис.4 Стафилококк
Рис.5 Стрептококк
Рис.6 Сарцина
Рис.7 Монобактерии
Рис.8 Стрептобацилла
Рис.9 Вибрион
Рис.10 Жгутики бактерий окраска по Бениньетти
Рис.11 Препарат “висячая капля”
Рис.12 Рост бактерий на среде Пешкова 1-подвижные бактерии; 2-неподвижные бактерии
не удается, ни в коем случае не следует опускать тубус, глядя в окуляр (можно раздавить покровное стекло), следует повторить всю установку сначала.
Установив в фокусе край капли, сдвигают его несколько в сторону, не теряя из поля зрения, и рассматривают подвижность бактерий. Препарат зарисовать.
Метод полужидких сред (Пешкова)
Среда представляет собой высококачественный полужидкий мясопептонный агар, разлитый в пробирки в виде столбика. Посев исследуемых бактерии производят уколом. Подвижные микроорганизмы на этой среде дают диффузный рост, неподвижные - рост по ходу укола. Рост подвижных и неподвижных микробов зарисовать.
Контрольные вопросы
Из каких трех основных систем состоит электронный микроскоп просвечивающего типа?
Почему разрешающая способность электронного микроскопа во много раз выше разрешающей способности светооптических микроскопов?
Какова длина волны электронов?
Для чего необходим высокий вакуум в колонне электронного микроскопа?
Какие линзы имеются в электронном микроскопе и какую роль они выполняют?
За счет чего создается видимое изображение объекта в электронном микроскопе?
Из чего складывается общее увеличение электронного микроскопа? . Каково назначение пленок-подложек и из какого материала они готовятся?
Каково назначение опорных сеток и из чего они готовятся?
Для чего применяют контрастирование объектов, изучаемых в электронном микроскопе?
В чем заключается принцип негативного и позитивного контрастирования?
В чем заключается сущность метода оттенения?
С какой целью и с помощью каких реактивов осуществляется фиксация препаратов для электронной микроскопии?
С какой целью производится обезвоживание объектов для электронной микроскопии?
Какие виды ножей используются для получения ультра тонких срезов?
Какие принципы положены в основу работы ультрамикротомов?
В чем преимущество использования ультратонких срезов для изучения структуры бактерий и вирусов?
В чем заключается сущность метода микроскопии в темном поле?
Что такое фазовоконтрастная микроскопия и в чем ее преимущества?
Какие формы имеют бактерии?
На какие группы делятся кокки и палочковидные формы по характеру взаиморасположения клеток?
В каких случаях употребляют термины "бактерии" и "бациллы"?
Как классифицируются бактерии в зависимости от количества и расположения жгутиков?
Что такое колония, культура и штамм бактерий?
На чем основан принцип окраски жгутиков, позволяющий наблюдать их в оптическом микроскопе?
Какие методы используются для определения подвижности бактерий?
Как готовится препарат "висячая капля"?
Как должно быть установлено освещение микроскопа при рассмотрении "висячей капли"?
Как избежать повреждения препарата при микроскопии "висячей капли" ("раздавленной капли")?
В чем заключается принцип фазовоконтрастной микроскопии?
Как растут подвижные и неподвижные бактерии при посеве уколом на полужидкую среду Пешкова?
З А Н Я Т И Е 3
Дата____________________
Тема: МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. СТРОЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.
План занятия
1.Знакомство с основными анилиновыми красителями и приготовлением их растворов для окрашивания микроорганизмов.
2.Приготовление препарата-мазка, фиксирование его, окрашивание и микроскопия.
3.Сложные методы окраски микробов. Окраска по Граму с применением контролей и без них.
4.Включения у бактерий. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
5.Капсула у бактерий. Окраска капсул в препаратах-мазках из культуры палочки Фридлендера по методу Бурри-Гинса.
6.Споры у бактерий. Исследование спор в неокрашенных препаратах (раздавленная капля) и в препаратах-мазках, окрашенных водным фуксином и по Клейну.
7.Изучение клеточных ультраструктур по электронограммам.
Методические указания
§ 2. На чистое предметное стекло нанести каплю воды. Прокаленной ж остуженной петлёй захватить очень небольшое количество микробной массы и коснуться ею капли так, чтобы оставить в ней облачко помутнения. Прокалить и остудить петлю и, перемешав каплю, размазать ее тонким слоем по стеклу, после чего петлю снова прокалить и поставить в штатив.
Подсушить приготовленный мазок на воздухе. Зафиксировать мазок путем проведения нижней стороной через пламя 3-4 раза. Фиксирование считается хорошим, если стекло, приложенное к тыльной поверхности кисти, дает ощущение легкого жжения. При отсутствии такого ощущения препарат может смыться, а при ощущении ожога микроскопическая картина будет искажена.
Положить препарат на мостик для окраски мазком вверх и налить на неге раствор краски - фуксин Пфейффера или метиленовый синий. Окраска фуксином производится в течение 1-2 минут, метиленовым синим - в течение 3-5 минут,
Слить краску и тщательно промыть препарат водой. Обсушить препарат фильтровальной бумагой. Микроскопировать с иммерсионным объективом. Микроскопическую картину зарисовать в тетрадь.