§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.

а) В шприц, объемом в I мл, берут 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия и отсасывают из краевой вены уха иммунизированного кролика кровь до I мл. После осторожного перемешивания крови с цитратом натрия ее выливают в пробирку и добавляют туда 0,5мл взвеси убитых бактерий. Вновь осторожно перемешивают кровь с бактериями, и пробирку помещают в термостат на 30 минут при 370, после чего готовят препараты-мазки. Для этого хорошо обезжиривают стекло и с помощью пастеровской пипетки осторожно отсасывают слой лейкоцитов, располагающихся в виде сероватой пленки над слоем эритроци­тов.

Рис.2 Результаты опыта РСК 1-опыт, 2-контроль сыворотки, 3-контроль антигена.

Каплю взятой взвеси лейкоцитов наносят на стекло и готовят мазок таким же образом, как для определения формулы белой крови. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 10 минут и окрашивают синькой Менсона в течение 30 секунд, промы­вают водой, обсушивают и рассматривают с иммерсионным объективом.

ПРОЦЕССИНГ АНТИГЕНА может осуществляться двумя способами в зависимости от его про­исхождения. Чужеродные агенты, находящиеся во внеклеточной среде (например, компоненты бактерий и паразитов), Рис.3 погло­щаются специализированными клетками(1), часто это мак­рофаг (слева) или В-лимфоцит (справа). В этих клетках поглощенный материал расщепляется и процессированный антиген вместе с белками MHC клас­са II экспонируется на клеточной поверхности, где представляется хелперным Т-лимфоцитам. Белки, Рис.4 образующиеся внутри зараженных вирусом или злокаче­ственных клеток (2),подверга­ются процессингу внутри самих этих клеток и появляются на их поверхности в сочетании с бел­ками МНС класса I. Их распознают цитотоксические Т-лимфо­циты.

Пример вычисления фагоцитарного числа

2	3	0	6	2
4	0	5	4	2
5	0	6	2	1
2	3	4	3	0
4	1	5	2	1

Фагоцитарное число равно

б) Для определения опсоно-фагоцитарного числа под микроскопом ведут подсчет бактерий, поглощенных лейкоцитами. Подсчитывают общее количество бактерии, поглощенных 25 лейкоцитами. Частное от де­ления числа фагоцитированных микробов на 25 является фагоцитарным числом для испытуемой иммунной сыворотки. Таким же образом определяется фагоцитарное число нормальной (неиммунной сыворотки). Отно­шение фагоцитарного числа иммунной сыворотки к фагоцитарному числу нормальной сыворотки называется опсоническим индексом.

Фагоцитарное число в вашем исследовании равно_______________________

в)Методика определения завершенности фагоцитоза. 18-20-часовая агаровая культура бактерий (1 мл около I млрд. клеток) добавляется к исследуемой крови и смесь выдерживается в течение 30- 45 минут в термостате при 37⁰ .

После этого готовят мазки для определения фагоцитарной актив­ности (ОФР).

Оставшуюся смесь (несколько капель) наносят на поверхность слабощелочного агара в чашке Петри, равномерно распределяют по площади 5x5 см и чашку помещают на 2 часа в термостат для подращи­вания бактерий.

Через 2 часа готовят препараты-отпечатки. Для этого вырезают из части агара, на которую наносили смесь лейкоциты-микробы, пла­стинку размером 2x4,5 см и помещают ее на предметное стекло той поверхностью, где нанесена смесь. После приготовления отпечатка с помощью пинцета пластинку сбрасывают, но так, чтобы не допустить ее скольжения по стеклу.

Препарат-мазок и препарат-отпечаток фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 25-30 минут (краску разводят перед употреблением из расчета 3 капли краски на I мл воды).

Для определения завершенности фагоцитоза в препарате-отпечатке подсчитывают 50 нейтрофилов и определяют процентное соотношение дезинтегрированных (разрушенных) и жизнеспособных клеток среди фагоцитированных микробов в лейкоците.

Погибшие бактерии при этом окрашены в розовый цвет или синий и находятся в разной стадии разрушения. Жизнеспособные клетки-более крупные и окрашены в интенсивно синий цвет.