§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.

Реакция агглютинации на стекле с 0- и Н-антигенами. На чистое хорошо обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят две капли сыворотки, содержащей 0- и Н-антитела. В одну аз них добавляют каплю антигена 0, в другую - каплю антигена Н. Антигены перемешивают с сыворотками (пользоваться разными петлями, или петлю прокаливать после перемешивания одной капли!). В капле, в которую был добавлен 0-антиген, образуется мелкозернистый осадок агглютинат, а в капле с Н-антигеном - крупнохлопчатыи агглютинат.

§ 3. Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пасте­ровской пипеткой каплю агглютинирующей сыворотки (полученной при иммунизации кроликов бараньими эритроцитами), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по одной капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки!). С помощью бактериальной петли перемеши­вают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при покачивании стекла и осторожном подогревании.

В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит, так как там отсутствуют антитела.

§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:

а) агглютинирующую сыворотку против водного вибриона в исход­ном разведении 1:25;

б)взвесь убитых вибрионов (диагностикум: содержащий в I мл I млрд микробных тел);

в)физиологический раствор;

г)две пипетки емкостью I мл и 5 мл ;

д) штатив с набором из 8 агглютинационных пробирок.

Порядок работы

1)пронумеровать все пробирки;

2)разлить по 0,5 мл физиологического раствора во все пробирки, за исключением первой;

3)налить в первую и во вторую пробирки по 0,5 мл сыворотки в разведении 1:25;

4)перемешать сыворотку с физиологическим раствором во второй пробирке и перенести пипеткой (емкостью I мл) 0,5 мл в третью про бирку, после перемешивания 0,5 мл разведенной сыворотки переносится таким же образом из третьей пробирки в четвертую, из четвертой в пятую и т.д. до седьмой пробирки, из седьмой пробирки 0,5 мл жидкости удаляется. В восьмой пробирке сыворотки не должно быть. Она служит контролем антигена. После такого разведения сыворотки во все пробирки, но уже другой пипеткой, добавляют антиген по 0,5 мл. Пробирки энергично встряхивают вместе со штативом (для перемешивания антигена с антителом) и помещают в термостат при 37⁰ на 2 часа, после чего читают предварительный результат. Окончательный результат опыта регистрируют через 24 часа.

Рис.1 Реакция агглютинации (1. O-агглютинация; 2. H-агглютинация).

Рис.2 Гемагглютинация (1.Опыт; 2.Контроль)

Контрольные вопросы

Какие виды антигенов имеются в микробной клетке?

Как готовится 0-диагностикум?

Как готовится Н-диагностикум?

Можно ли макроскопически отличить 0-агглютинацию от Н-агглю-тинации, если да, то по каким признакам?

Какое различие между поливалентными и моновалентными диагностическими агглютинирующими сыворотками?

Как получают поливалентные и моновалентные агглютинирующие сыворотки?

Каким образом можно очистить сыворотку от групповых антител? Что понимается под титром агглютинирующей сыворотки?

Какова методика постановки развернутой реакции агглютинации? Какие приемы используются для ускорения капельной агглютинации на стекле?

Почему 0-агглютинация имеет мелкозернистый, а Н-агглютинация крупнохлопчатый характер?

Как получают иммунную сыворотку, агглютинирующую эритроциты?

ЗАНЯТИЕ 11

Дата___________________

Тема: ИММУНИТЕТ. РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ

План занятия

1.Регистрация результатов опыта по определению титра агглютинирующей сыворотки.

2.Использование классического пробирочного метода реакции агглютинации для:

а) определения титра антител в сыворотке больного (серологический метод диагностики);

б) определения антигенного строения выделенного возбудителя (серологическая идентификация возбудителя в ходе бактериологического исследования).

3.Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), или непрямой гемагглютинаций (НПГА). Варианты использования РПГА.

4.Варианты реакций агглютинации на стекле, которые используют в качестве методов экспресс-диагностики:

а) реакция коагглютинации;

б) реакция летекс-агглютинации;

в) реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) и др.

5.Реакция преципитации. Получение бактериального гаптена и постановка реакции кольцепреципитации.

6. Реакция преципитации в геле (агаре) для определения:

а)природы антигена;

б)природы антител.

7.Применение методов иммуносорбентного анализа твердой фазы:

а)применение иммуноферментного метода (ИФМ);

б)применение радиоиммунного метода (РИМ).

8.моноклональные антитела и их применение.

Методические указания