3Анятие 3

Дата_______________

Тема: МИКРОБИОЛ0ГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

План занятия

А. Микробиологический диагноз острых респираторных заболеваний

Разбор схем исследования

1. Вирусологический диагноз гриппа. Заражение вирусосодержащим материалом куриных эмбрионов в аллантоисную полость.

2. Серологический диагноз гриппа. Определение титра антител в сыворотке переболевших с помощью РТГА и РСК.

3. Ускоренный метод диагностики гриппа с помощью иммунофлуоресценции (разбор и демонстрация).

Б. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

1.Вирусологический диагноз полиомиелита. Заражение вирусосодержащим материалом культуры клеток эпителия почки обезьяны.

2.Серологический метод диагностики полиомиелита: а) обнаружение типа и титра антител к вирусу полиомиелита методом цветной пробы (демонстрация); б)обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации (разбор).

В. Микробиологический диагноз клещевого весенне-летнего энцефалита. Разбор схем диагностики.

Г. Микробиологический диагноз бешенства. Разбор схемы исследования.

Методические указания

А. Микробиологический диагноз острых респираторных заболеваний

§ IВирусологический диагноз гриппа. Материалом для заражения куриных эмбрионов (с целью выделения вируса гриппа) служит смыв из носоглотки. Смыв производится путем неоднократного прополаскивания носоглотки с помощью 10 мл стерильного физиологического раствора. Смыв фильтруют через вату и обраба­тывают антибиотиками (100 ед. пенициллина и 100 ед. стрептомицина на I мл смыва) в течение 20-30 минут. После этого материал становится пригодным для заражения куриных эмбрионов. Для заражения ис­пользуют эмбрионы 10-11-дневного возраста. Заражение производят в аллантоисную полость обычным способом (см.занятие 2).

§ 2. Серологический диагноз гриппа. Реакцию торможения геммагглютинации для обнаружения противогриппоз­ных антител ставят с парными сыворотками больных гриппом: с сывороткой, взятой в первые дни заболевания и хранящейся на холоде, и с сы­вороткой, взятой на 12-20 день после заболеваний. Сыворотки пред­варительно обрабатывают для инактивации неспецифических ингибиторов, тормозящих реакцию гемагглютинации, и последовательно разводят каждую из них в нескольких рядах пробирок (соответственно чис­лу типовых вирусных антигенов) в объеме 0,25 мл от 1:4 до 1:1280. Во все пробирки каждого ряда вносят по 0,25 мл суспензии антигена, содержащего 4 гемагглютинирующих дозы вируса и после встряхивания по 0,5 мл 1%-ной взвеси куриных эритроцитов. Оставляют на 45-60 минут при комнатной температуре и учитывают результаты реакции. При нейтрализации вируса антителами сыворотки склеивания эритроцитов не происходит (положительная РТГА). Титр антител определяют по мак­симальному разведению сыворотки, вызывающему торможение гемагглютинации. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител. Результаты РТГА зарегистрировать.

Реаксцию связывания комплемента ставят по классической схеме.

§ 3. Иммунофлуоресцентный метод диагностики.

Материал для исследования готовится как при люминесцентном методе. Осадок наносят на предметное стекло и обрабатывают специфической люминесцирующей сывороткой, промывают проточной водой, вы­сушивают и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки, содержащие вирус, адсорбируют специфические люминесцирующие антитела и светятся. В препарате необходимо искать неразрушен­ные эпителиальные клетки.

Б. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

§ I. Вирусологический диагноз полиомиелита . Материалом для диагностики полиомиелита слу­жат испражнения больного, готовят 10%-ную взвесь испражнений в растворе Хэнкса, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают ан­тибиотиками (1000 ед, пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на I мл). Подготовленный таким образом материал смешивают со свежей питатель­ной средой. Выросшую однослойную культуру ткани просматривают под микроскопом и отбирают пригодную для заражения. Стерильной пастеров­ской пипеткой отсасывают питательную среду. В культуру ткани вносят I мл материала в свежей питательной среде и пробирку ставят в гори­зонтальном штативе в термостат.

§ 2. Серологический диагноз полиомиелита . Определение антител и их, титра к вирусу полиомиели­та производят с помощью метода цветной пробы. Сыворотку больного полиомиелитом разводят в пробирках от 1:4 до 1:64 в объеме 0,25 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл вируса полиомиелита и по 0,4 мл вазелинового масла. Через 40-60 минут в пробирки вносят по 0,25 мл клеточной суспензии, содержащей 100000 живых клеток в 1 мл. После инкубирования пробирок в термостате в течение 3-7 дней учитывают результат. Пожелтение среда в пробирках указывает на нейтрализацию вируса антителами и рост культуры клеток. Наибольшее разведение сы­воротки, нейтрализующее вирус, является титром сыворотки.

Обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации

Реакция преципитации в агаре широко используется для диагнос­тики вирусных заболеваний (полиомиелита, коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.

Постановка реакции преципитации на предметных стеклах. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждённого до 60⁰ агара (1%-ный агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4 мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могут быть различными в зависимости от условий опыта. Объем исполь­зуемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и в каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый антиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципи­тации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.

Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.

Рис.1 Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена. Обозначения: Сс - сыворотка специфическая Сн - сыворотка нормальная Ас - антиген сцецифический Аи - антиген искомый

Рис.2 Схема постановки и результаты опыта по определению типа и титра противогриппозных антител в сыворотке больного.

Рис.3 Схема определения титра антител методом цветной пробы.

Сыворотка в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—	—
Вирус в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—	—	0,25
Клетки в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

Заключение:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вирусологический (диагностика ОРЗ)

Рис.4 Смыв из носоглотки, обработанный антибиотиками

Заражение куриных эмбрионов в аллантоисную или амниотическую полости. Вирус обнаруживают путем реакции гемаг-глютинации, типируют с помощью РТГА

Заражение культуры ткани. В культуре ткани вирус обнаруживают по цитопатическому эффекту, по изменению цвета среды и по реакции гамадсорбции; типируют по РТГА, нейтрализации ЦПЭ и реакции гемадсорбции.

Заражение белых мышей. Типируют вирус мотодом нейтрализации со специфическими сыворотками.

I. Методы микробиологической диагностики острых респираторных заболеваний

А. Вирусоскопический

Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.

Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирущими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентно­го микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорби­руют специфические люминесцирующие антитела и светятся.

Б. Вирусологический (см. схему).

В. Серологический

Определяют нарастание титра специфических антител в исследуе­мых парных сыворотках с помощью РТГА, РСК и РН (см. схему).

П. Методы микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций

А. Вирусологический

Поскольку вирусы Коксаки и ЕСНО могут вызывать полиомиелитоподобные заболевания, исследование ведется с целью возможного выде­ления любого из трех видов вируса, для чего вирус выделяется пара­ллельно на культурах ткани и заражением однодневных мышей. (Схему см. ниже Рис.5). Материал: испражнения, иногда спинномозговая жидкость, слизь из зева, кровь.

Цитопатический эффект и образование бляшек (вирусы Коксаки часто не вызывают цитопатического эффекта).

Титрование выделенных вирусов с помощью реакции нейтрализации на культуре ткани с сыворотками против вирусов полиомиелита, вирусов Коксаки А и В, вирусов EСНО. При совпадении типов вируса и сыворот­ки отмечается рост культуры, изменение цвета среды и отсутствие бля­шек.

Параличи и смерть наступают в присутствии вирусов Коксаки А и В.

Вирусы Коксаки А через 3-5 дней вызывают вялые параличи мышц с ценкеровским некрозом.

Вирусы Коксаки В через 6-8 дней вызывают некроз бурого жира в межлопаточной области и спастические параличи в результате поражения центральной нервной системы.

Б. Серологический

Обнаружение нарастания антител в крови больных к выделенным вирусам ECHO производят с помощью РТГА, к вирусам Коксаки - по реак­ции нейтрализации и цветной пробе, к вирусам полиомиелита - по реак­циям нейтрализации, преципитации и РСК.

Дифференциальные признаки энтеровирусов.

Вирусы	Культивирование		Патогенность			Агглютинация эритроцитов (серотипы)
	Клетки обезьян	Клетки человека	мыши	обезьяны
Полио	+	+	—	+	—
Коксаки А	—	—*	+	—	20, 21, 24
Коксаки В	+	+	+	—	1-6
ECHO	+	—	—	—	3, 6, 7, 10-16, 19, 20,23,25,29

Примечание: В каждой подгруппе вирусов есть исключения для отдельных серотипов.

*Вирусы Коксаки А типов 11, 13, 15, 18, 20, 21 могут культивироваться в клетках человека.

Клинические синдромы, вызываемые вирусами Коксаки и ECHO.

№ пп	Клинические синдромы	Типы вирусов
1.	Эпидемическая миалгия	Коксаки В 1-6
2.	Герпангина	Коксаки А1-6,8,10,16,22; В 3
3.	Острый серозный минингит (энцефалит, менингоэнцефалит, энцефаломиелит)	Коксаки A 2, 4, 7, 9, 15; В 1-6 ЕСНО 1-7,9,11,13,14,16,18,20,21
4.	Малая болезнь	Коксаки А 2-4, В 1-6 ЕСНО 6,7,9,20
5.	Острое респираторное заболевание	Коксаки А-21, В 3,4 ECHO7, 11, 20
6.	Гастроэнтерит	Коксаки А 2,9; B 1-5 ECHO 2,5, 6-12, 14, 18, 22-24
7.	Миокардит и энцефаломиокардит новорожденных; доброкачественный миокардит и перикардит взрослых.	Коксаки B 1-5
8.	Полиомиелитоподобные заболевания	Коксаки А 4,7, 9, 10,14; В 1-5 ECHO 2, 4, 6, 9, 11,16
9.	Везикулярный стоматит с кожным проявлениями	Коксаки А 5, 16
10.	ECHO-экзантема	ECHO 2, 4, 6, 9,14, 16, 18

Методы микробиологической диагностики клещевого энцефалита.

Материал: кровь, спинномозговая жидкость, секционный материал (ткань головного мозга).

Рис. 6.

А. Вирусологический Б. Биологический

Заражение культур клеток почек Заражение белых мышей

и фибробластов куриных эмбрионов

ЦПЭ Типирование вируса с помощью реакции нейтрализации на мышах или культуре ткани, а также по РТГА и РСК.

Отсутствие ЦПЭ Зражение мышей культуральной жидкостью

Параличи и гибель мышей через 10-12 дней

В. Серологический

Материал: сыворотка больного

РСК РТГА Реакция нейтрализации

на мышах или в культуре клеток

Методы микробиологической диагностики бешенства

А. Вирусоскопический

Материал:ткань аммонова рога, мозжечка, продолговатого мозга. Рис.7

Микроскопия мазков-отпечатков или мазков, приготовленных из эмульсии мозга и окрашенных по Манну (Туревичу), на наличие телец Негри (малинового цвета). При наличии флуоресцирующих антител применяют метод люминесцентной микроскопии.

Б. Биологический

Материал: мозговая ткань, слюна животных.

Внутримозговое заражение белых мышей. При наличии вируса бешенства мышь через 7-9 дней заболевают и гибнут. При микроскопии мазков из мозговой ткани обнаруживают внутриклеточные включения Негри.

Контрольные вопросы

Какие вирусы вызывают острые респираторные заболевания?

Какие вирусы относятся к группе ортомиксовирусов?

Дайте общую характеристику ортомиксовируоов?

Какую структуру имеет вирион гриппа?

Какие микробиологические методы применяются для диагностики вирусных респираторных инфекций?

В чем особенность серологических методов диагностики вирусных респираторных инфекций?

Как производится выделение вируса гриппа?

Как обнаруживается вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как производится выделение и идентификация аденовирусов?

В чем сущность РТГА? Каковы особенности ее постановки и учета результатов при обнаружении противогриппозных антител?

В чем заключается сущность иммунофлуоресцентного метода диагностики гриппа?

Какова классификация пикорнавирусов?

Дайте общую характеристику группы энтеровирусов.

Какие микробиологические методы применяют для диагностики полиомиелита и других энтеровирусных заболеваний?

Каков патогенез полиомиелита?

Как выделяют вирус полиомиелита от больных?

Какие серологические методы диагностики могут быть использова­ны при полиомиелите?

Какие заболевания вызывают вирусы Коксаки и ЕСНО?

Какие способы применяются для обнаружения и выделения вирусов Коксаки?

Как обнаруживают и идентифицируют вирусы Коксаки А и В?

В чем сущность реакции преципитации в агаре?

С какой целью используется реакция препитации в агаре в вирусологии?

Как определяется гемагглютинирующий титр вируса гриппа?

Как определяется цитопатическое действие вируса полиомиелита?

Какие микробиологические методы применяются для диагностики бешенства?

Чем отличаются фиксированный и уличный вирусы бешенства?

Каковы основные свойства вируса клещевого энцефалита?

Какие микробиологические методы применяются для диагностики клещевого энцефалита?

Каковы пути заражения А-,В-,дельта-гепатитами?

Что такое вирусный В - гепатит? С- и Е-гепатиты?

Какие биохимические тесты применяются для диагностики вирусного гепатита?

Что такое интерферон?

Приложение к занятию 3

А. Возбудители острых респираторных заболеваний (ОРЗ).

Возбудителями ОРЗ (кроме бактерий) являются следующие вирусы:

РНК-содержащие

1.Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А, В и С).

2.Парамиксовирусы парагриппозные вирусы, вирус эпидемического паротита, вирус ньюкаслской болезни, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус).

3.Пикорнавирусы (более 110 серотипов риновирусов, а также некоторые серотипы вирусов Коксаки (А и В) и ECHO).

4.Реовирусы (3-й серотип).

5.Коронавирусы.

ДНК-содержащие вирусы

6. Аденовирусы (41 серотип, из них 8 являются возбудителями ОРЗ).

По частоте - риновирусы - коронавирусы - респираторносинцитиальный вирус - парагриппозные вирусы - аденовирусы - вирусы гриппа. Однако основную роль играет вирус гриппа, вызывающий частые пандемии.

Вирусы гриппа обозначают по однородной кодированной системе. Указывают тип рибонуклеопротеида (род вируса) - А,В,С, географическое место выделения штамма; порадковый номер; год; в круглых скоб­ка - подтип гемагглютинина (Н1-Н13) и нейрамидазы (N I - N 10). Например, А(Сингапур). 1,57 (Н2 N2), А (Гонконг), 1,68 (НЗ N 2).

Для диагностики ОРЗ применяются следующие методы:

1.Вирусологические - заражение культур клеток и эмбрионов.

2.Иммунофлуоресцентный (метод ускоренной диагностики).

3.Серологические реакции - РТГА, РСК, ИМФ.

4.Использование РНК- зонда,

Б. Возбудителями острых кишечных заболеваний (ОКЗ), кроме бактерий, являются следующие вирусы:

1.Полиовирусы (три серотипа).

2.Вирусы ECHO - 34 серотипа.

3.Вирусы Коксаки А - 23 серотипа

4.Вирусы Коксаки В - 6 серотипов.

5.Энтеровирусы - серотипы 68-71.

6.Вирус гепатита А ( 72-й серотип).

7.Ротавирусы - 4 ееротипа.

8.Калицивирусы - вирус Норвольк и др.

9.Астровирусы.

10.Корокавирусы - 3-й серотип.

11.Аденовирусы - некоторые серотипы.

Основные признаки энтеровирусов, по которым они объединяются в один род