2.7.16. Количественное определение вакцины коклюша (бесклеточной)

Способность вакцины вызывать образование специфических антител сравнивают с аналогичным свойством параллельно испытываемого препарата сравнения; антитела определяют с использованием подходящего иммунохимического метода (2.7.1), например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). В приведенном ниже описании испытания на мышах используется трехточечная модель, однако, после валидации, для рутинных испытаний может быть использован метод однократного разведения.

Вакцина сравнения. В качестве вакцины сравнения используют партию вакцины, эффективность которой показана клиническими испытаниями, или репрезентативную партию этой вакцины. Для приготовления репрезентативной партии необходимо строгое соблюдение технологического процесса при производстве партии, подвергающейся клиническим испытаниям. Стабильность вакцины сравнения должна быть документально подтверждена.

Требования. Способность вакцины вызывать образование антител не должна быть существенно ниже (Р = 0,95) по сравнению с аналогичным свойством препарата сравнения.

Следующая модель испытания приводится в качестве примера метода, пригодность которого для данного испытания подтверждена.

Отбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей (например, линии CD1) из одной партии возрастом от 4 до 8 недель. Животных распределяют по шести группам, состоящим из количества особей, достаточного для выполнения требований испытания. Используют три разведения испытуемой вакцины и три разведения препарата сравнения и назначают каждой из групп одно из разведений. Каждому животному внутрибрюшинно или подкожно вводят по 0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное относится.

Отбор образцов сыворотки. Через 4-5 недель после вакцинации проводят забор крови у мышей под анестезией. Сыворотки до определения содержания антител хранят при -20⁰С.

Определение антител. Выполняют количественное определение содержания специфических в отношении каждого из компонентов антител в сыворотках с использованием метода с подтвержденной достоверностью, например, ELISA, методика которого приведена ниже.

Испытание ELISA. Титрационные микропланшеты, выполненные из поливинилхлорида или полистирола, в соответствии с требованиями специфического антигена, покрывают очищенным антигеном в концентрации 100 нг на одну ячейку. После промывки непрореагировавшие участки блокируют путем инкубации с раствором бычьего сывороточного альбумина и последующей промывки. Производят на планшетах двукратные разведения сывороток мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и вакциной сравнения. После инкубации при 22-25⁰С в течение 1 часа планшеты промывают. После промывки добавляют хромогенный субстрат, высвобождающий под воздействием присоединенного ферментного конъюгата хромофор, который может быть количественно определен путем измерения оптической плотности (2.2.25). Выбирают такие условия испытания, чтобы в рабочем диапазоне измерений имелась линейная зависимость оптической плотности от содержания антител, а значения оптической плотности находились в пределах от 0,1 до 2,0.

В испытании используется контрольная антисыворотка установленной активности, служащая основанием для вычисления содержания антител в испытуемой сыворотке. Также в испытании используется стандартизированная контрольная сыворотка.

Результаты испытания являются недостоверными, если:

• значение, определенное для контрольной сыворотки, отличается от приписанной величины более чем на удвоенное значение стандартного отклонения,

• доверительный интервал оценочного значения активности шире, чем от 50 до

200%.

Вычисления. Вычисляют титры антител в сыворотках мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и препаратом сравнения, и из полученных значений с использованием обычных статистических методов определяют активность испытуемой вакцины относительно вакцины сравнения.