2.5.20. Гексозамины в полисахаридных вакцинах

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема. Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема водой Р. Раствор разводят таким образом, чтобы объемы, используемые для опыта, содержали от 125 мкг до 500 мкг глюкозамина (гексозамина). В градуированную пробирку вносят 1,0 мл разведенного раствора.

Стандартные растворы. 60 мг глюкозамин гидрохлорида Р растворяют в 100 мл воды Р (основной раствор, содержащий 0,500 г/л глюкозамина). Помещают 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл, и 1,0 мл рабочей концентрации в 4 градуированные пробирки.

Готовят контрольную пробу, используя 1 мл воды Р.

Доводят объем в каждой пробирке до 1 мл водой Р. В каждую пробирку прибавляют 1 мл (292 г/л) раствора кислоты хлористоводородной Р. Закрывают пробирки пробками и помещают в водяную баню на 1 ч. Охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 0,05 мл (5 г/л) раствора тимолфталеина Р в спирте Р. Прибавляют раствор 200 г/л натрия гидроксида Р до голубого окрашивания, а затем раствор 1 М кислоты хлористоводородной до обесцвечивания раствора. Доводят объем в каждой пробирке до 10 мл водой Р (нейтрализованные гидролизаты).

Во вторую серию градуированных пробирок объемом 10 мл вносят 1 мл каждого нейтрализованного гидролизата. В каждую пробирку добавляют 1 мл ацетилацетонового реактива (смесь, приготавливаемая непосредственно перед использованием - 1 объем ацетилацетона Р и 50 объемов раствора 53г/л натрия карбоната безводного Р). Закрывают пробирки пробками и помещают на водяную баню при температуре 90 C на 45 мин. Охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 2,5 мл спирта Р и 1,0 мл раствора диметиламинобензальдегида (приготавлитвают непосредственно перед использованием: растворяют 0,8 г диметиламинобензальдегида Р в 15 мл спирта Р, добавляют 15 мл кислоты хлористоводородной Р) и доводят объем в каждой пробирке до 10 мл спиртом Р. Пробирки закрывают, содержимое перемешивают переворачивая пробирки и оставляют в темном месте на 90 мин. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 530 нм, используя контрольную пробу в качестве раствора сравнения. Строят градуировочный график на основании оптических плотностей для 4 стандартных растворов и соответствующего содержания гексозамина и определяют значение количества гексозамина в исследуемом растворе.

2.5.21. Метилпентозы в полисахаридных вакцинах

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида используют мерную колбу необходимого объема. Содержимое контейнера количественно переносят в колбу и разводят до необходимого объема водой Р. Раствор разводят таким образом, чтобы объемы, предназначенные для тестирования, содержали от 2 мкг до 20 мкг рамнозы (метилпентозы). В три пробирки помещают 0,25 мл, 0,50 мл и 1,0 мл разведенного раствора.

Стандартные растворы. Разводят 0,100г рамнозы Р в 100мл воды Р (основной раствор, содержащий 1г/л метилпентозы). Непосредственно перед использованием разводят 1 мл основного раствора до 50 мл водой Р (рабочая концентрация 20мг/л метилпентозы). В 5 пробирок помещают 0,10 мл, 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл и 1,0 мл рабочей концентрации.

Готовят контрольную пробу с использованием 1 мл воды Р

Объем в каждой пробирке доводят до 1 мл с использованием воды Р. Пробирки помещают в ледяную воду, прибавляют по каплям с постоянным помешиванием по 4,5 мл охлажденной смеси, состоящей из одного объема воды Р и 6 объемов кислоты серной Р. Пробирки нагревают до комнатной температуры и помещают на водяную баню на несколько минут. Охлаждают до комнатной температуры. Добавляют в каждую пробирку 0,10 мл раствора 30 г/л цистеин гидрохлорида Р приготовленного непосредственно перед применением. Взбалтывают и дают отстояться в течение 2 ч.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 396 нм и 430 нм, используя контрольную пробу в качестве раствора сравнения. Для каждого раствора рассчитывают разницу между оптической плотностью, измеренной при длине волны 396 нм и оптической плотностью, измеренной при длине волны 430 нм. Строят градуировочный график на основании разницы оптических плотностей для 5 стандартных растворов и соответствующей концентрации метилпентозы, а также строят график концентрации метилпентозы в исследуемом растворе для каждого тестируемого объема. Рассчитывают среднюю величину по трем значениям.

22. УРОНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема. Переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до необходимого объема водой Р. Раствор разводят таким образом, чтобы объемы, предназначенные для исследования, содержали от 4 мкг до 40 мкг глюкуроновой кислоты (уроновых кислот). В 3 пробирки помещают 0,25 мл, 0,50 мл и 1,0 мл разведенного раствора.

Стандартные растворы. Растворяют 50 мг натрия глюкуроната Р в 100 мл воды Р (основной раствор, содержащий 0,4 г/л глюкуроновой кислоты). Непосредственно перед использованием разводят 5 мл основного раствора до 50 мл, используя воду Р (рабочая концентрация глюкуроновой кислоты 40 мг/л). В 5 пробирок помещают 0,10 мл, 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл, и 1,0 мл рабочей концентрации.

Готовят контрольную пробу, используя 1 мл воды Р.

Доводят объем в каждой пробирке до 1 мл водой Р. Помещают пробирки в ледяную воду и, постоянно помешивая, по каплям добавляют в каждую пробирку по 5,0 мл боратного раствора Р. Закрывают пробирки пробками и помещают на 15 мин на водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 0,20 мл раствора 1,25 г/л карбазола Р в этаноле Р. Закрывают пробирки пробками и помещают на 15 мин на водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 530 нм, используя контрольную пробу в качестве раствора сравнения.

Строят градуировочный график оптических плотностей для 5 стандартных растворов и соответствующих концентраций глюкуроновой кислоты, и определяют концентрации глюкуроновой кислоты в исследуемом растворе для каждого тестируемого объема. Рассчитывают среднюю величину по трем значениям.

23. СИАЛОВАЯ КИСЛОТА В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Содержимое одного или нескольких контейнеров количественно переносят в мерную колбу соответствующего объема. Чтобы получить раствор с концентрацией полисахарида около 250 мкг/мл, содержимое разводят до необходимого объема водой Р. 4,0 мл этого раствора переносят с помощью шприца в 10 мл ультрафильтрационную кювету, пропускающую молекулы с относительной молекулярной массой менее 50 000. Дважды промывают шприц водой Р и промывную жидкость тоже переносят в ультрафильтрационную кювету. Проводят ультрафильтрацию, постоянно перемешивая жидкость, в присутствии азота под давлением около 150 кПа. Наполняют кювету водой Р каждый раз, когда объем жидкости в ней уменьшается до 1 мл до тех пор, пока не профильтруется 200 мл, а оставшийся объем в кювете не будет составлять 2 мл. Используя шприц, переносят оставшуюся жидкость в 10 мл мерную колбу. Промывают кювету 3 раза по 2 мл водой Р каждый раз. Смывную жидкость сливают в колбу и доводят объем до 10 мл водой Р (испытуемый раствор). В каждую из двух опытных пробирок вносят 2,0 мл испытуемого раствора.

Стандартные растворы. Используют стандартные растворы, описанные в частной статье.

Готовят 2 серии из 3 пробирок. В пробирки каждой серии помещают 0,5 мл, 1,0 мл и 1,5 мл стандартного раствора, соответствующего типу вакцины, предназначенной для исследования, и корректируют водой Р объем в каждой пробирке до 2-х мл. Готовят контрольную пробу, используя 2,0 мл воды Р в каждой из двух пробирок.

В каждую пробирку добавляют 5,0 мл резорцинового реактива Р. Нагревают при 105° С в течение 15 мин, охлаждают в холодной воде и переносят пробирки на баню с ледяной водой. Во все пробирки добавляют 5 мл спирта изоамилового Р и тщательно перемешивают. Помещают в емкость с ледяной водой на 15 минут. Центрифугируют пробирки и держат их в емкости с ледяной водой до проведения исследования методом абсорбционной спектрофотометрии. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) надосадочной жидкости при длинах волн 580 нм и 450 нм, используя спирт изоамиловый Р в качестве раствора сравнения. Для каждой длины волны рассчитывают оптическую плотность как среднее значений, полученных в двух идентичных растворах. Вычитают среднее значение для контрольного раствора из средних значений, полученных для других растворов.

Строят график, отражающий разницу между оптической плотностью при длинах волн 580 нм и 450 нм стандартных растворов как функцию содержания N-ацетилнейраминовой кислоты и определяют концентрации N-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты) в исследуемом растворе.