7.4. Внешняя оценка качества

Участие во внешних программах оценки качества представляет собой важную процедуру обеспечения качества ПЦР-анализов для каждой лаборатории и каждо­го оператора.

Следующий раздел приводится для информации.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (МАНК) В ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С (HCV) В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ: РУКОВО­ДСТВО

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Большинство аналитических методик, основанных на амплификации нук­леиновых кислот, представляют собой качественные испытания на наличие нук­леиновых кислот. Существует также некоторое количество методик количествен­ного определения (либо внутренних, либо коммерчески доступных). Для опреде­ления загрязнения пулов плазмы РНК HCV адекватными являются качественные тесты, которые могут быть рекомендованы как предельные испытания при кон­троле содержания примесей, в соответствии с указаниями в Техническом руково­дстве по разработке монографий «Pharmeuropa», декабрь 1999, глава III «Вали-дация аналитических методик». В этом руководстве описаны лишь методы вали-дации качественных аналитических методик оценки загрязнения пулов плазмы РНК HCV на основе амплификации нуклеиновых кислот. Поэтому двумя наиболее важными характеристиками для валидации аналитического метода являются его специфичность и предел детекции. Кроме того, должна быть оценена устойчи­вость аналитического метода.

Однако этот документ также может быть использован в качестве ос­новы для валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.

Для целей данного документа, за аналитическую процедуру принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекции амплифицированного продукта.

При использовании в аналитическом методе или его части коммерческого набора, валидацию пользователя может заменить документированное подтвер­ждение валидации вышеуказанных положений, произведенной изготовителем на­бора. Тем не менее, пользователем должна быть продемонстрирована произво­дительность набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. пре­дел детекции, устойчивость, перекрестная контаминация).

2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность представляет собой способность к однозначной оценке присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать.

Специфичность аналитических методов, основанных на амплификации нук­леиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа ко­нечного продукта) и обоснованности условий проведения испытания (как для ста­дии амплификации, так и для стадии детекции).

При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их специ­фичность в отношении детектирования только РНК HCV путем сравнения избран­ной последовательности с последовательностями, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5'-некодируемого участка генома HCV, которые хорошо сохраняются для всех гено­типов.

Амплифицированный продукт должен однозначно идентифицироваться од­ним из многих методов, например, проведением амплификации с вложенными праймерами, анализ с использованием ферментов рестрикции, секвенирование или гибридизация со специфическим зондом.

Для валидации специфичности аналитического метода испытание должно быть проведено в отношении не менее 100 РНК HCV-отрицательных пулов плаз­мы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Подходящие образцы пулов, не дающих реакции, могут быть получены в Европейском директорате по качеству медицинских препаратов.

Способность аналитического метода к детекции всех генотипов HCV также зависит от выбора праймеров, зондов и параметров метода. Эта способность должна быть продемонстрирована с использованием характеризованных эталон­ных панелей. Однако, ввиду сложности получения некоторых генотипов (напри­мер, генотипа 6), должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе - генотипы 1 и 3).

3. ПРЕДЕЛ ДЕТЕКЦИИ

За предел детекции данной аналитической процедуры принимают наи­меньшее количество нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детек­тировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитический ме­тод с использованием амплификации нуклеиновых кислот, используемый для де­текции РНК HCV в пулах плазмы, обычно дает качественные результаты. Количе­ство возможных результатов ограничено двумя: либо положительным, либо отри­цательным. Хотя рекомендуется определение предела детекции, в практических целях для аналитического метода на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено положительное граничное значение. Положительное граничное значение (в соответствии с определением в общем разделе 2.6.21) представляет собой минимальное количество последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. На это поло­жительное граничное значение оказывают влияние распределение вирусных ге­номов в индивидуальных испытуемых образцах и такие факторы, как эффектив­ность фермента. Это может привести к получению различных 95% граничных зна­чений для отдельных испытаний.

Для определения положительного граничного значения ряд разведений ра­бочего реагента или стандартного образца вируса гепатита С BRP, калиброван­ного в сравнении с Международным Стандартом HCV ВОЗ 96/790, должен быть подвергнут испытанию в разные дни для проверки изменчивости результатов анализа. Для проведения статистического анализа результатов должно быть ис­пытано не менее трех независимых рядов разведений в количестве повторностей для каждого из разведений, достаточном для получения всего 24 результатов ис­пытания для каждого разведения.

Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведе­ний в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разведе­ний не было слишком большим, следует провести предварительное испытание (например, с использованием логарифмических разведений образца пула плаз­мы) с получением предварительного положительного граничного значения (т.е. наибольшего значения, дающего положительный результат). После этого диапа­зон разведений может быть выбран в области полученного предварительного значения (с использованием, например, логарифмического фактора разведения 0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концен­трация РНК HCV, которая может быть детектирована в 95% испытаний, может быть вычислена с использованием соответствующих методов статистической оценки.

Эти результаты также могут служить для демонстрации изменчивости ре­зультатов, получаемых данным аналитическим методом, в ходе испытания и в разные дни.

4. УСТОЙЧИВОСТЬ

Устойчивость аналитического метода - мера его способности выдерживать воздействие малых, но определенных изменений параметров метода, являющая­ся показателем его надежности при обычном использовании.

Оценка надежности должна проводиться в фазе разработки. Она должна показать надежность аналитической процедуры с учетом определенных вариаций параметров метода. Для случая МАНК, небольшие изменения параметров метода могут иметь решающее значение. Однако, в ходе разработки метода его устойчи­вость может быть продемонстрирована небольшим изменением концентраций реагентов (например, MgCl₂, праймеров или dNTP). Для демонстрации устойчиво­сти не менее 20 РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, отобранных случайным образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в три раза превышающей заранее определенное 95% граничное значение, должны быть испытаны и признаны положительными.

Проблемы с устойчивостью могут возникнуть также в связи с методами, в которых экстракции вирусной РНК предшествует стадия ультрацентрифугирова­ния. Поэтому для испытания устойчивости таких методов не менее 20 пулов плазмы, содержащих различные уровни РНК HCV, но не содержащих специфиче­ских антител к HCV, должны быть испытаны и признаны положительными.

Предотвращение перекрестной контаминации должно быть продемонстри­ровано путем точной детекции панели из не менее 20 образцов, попеременно за­полненной образцами отрицательных пулов плазмы и отрицательных пулов плаз­мы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного 95% граничного значения или не менее 10⁴ МЕ/мл).

5. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА

Для таких биологических испытаний, как МАНК, имеется вероятность воз­никновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валидацию, так и на интерпретацию результатов. Методики испытаний должны быть четко описаны в форме стандартных операционных процедур (СОП). В них должно ука­зываться:

• способ отбора проб (тип контейнеров и т. д.),

• приготовление мини-пулов (по потребности),

• условия хранения до анализа,

• точное описание условий испытания, включая меры предосторожности против перекрестной контаминации и деструкции вирусной РНК, используемых реагентов и стандартных препаратов,

• точное описание используемой аппаратуры,

• детальные формулы для вычисления результатов, включая статистическую об­работку.

В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы и надеж­ности аналитической процедуры, когда бы она ни использовалась, может быть ре­комендован подходящий контроль процесса (например, подходящее разведение стандартного образца вируса гепатита С BRR или образец плазмы, инфициро­ванной HCV, калиброванным в сравнении с Международным Стандартном HCV ВОЗ 96/790).

Техническая квалификация: каждой критической части используемого обо­рудования должна соответствовать программа квалификации по установке и экс­плуатации. После замены критически важного оборудования (например, устройств для термоциркуляции) должна быть документально подтверждена производи­тельность путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных образцов пула плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной кон­центрации, соответствующей предварительно определенному трехкратному 95% граничному значению. Все результаты должны быть положительными.

Квалификация оператора: в отношении каждого оператора, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствующая квалификационная программа. Для подтверждения соответствующего уровня подготовки каждый оператор должен провести испытание не менее 8 повторяющихся образцов пула плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной концентрации, соот­ветствующей предварительно определенному трехкратному 95% граничному зна­чению. Это испытание (8 повторяющихся образцов) должно быть повторено два­жды, в два различных дня. Таким образом, должно быть проведено 24 испытания на протяжении трех дней. Все результаты должны быть положительными.