2.2.46. Хроматографические методы разделения

Хроматографическими называют многостадийные методы разделения, в которых компоненты образца распределяются между двумя фазами, одна из которых является неподвижной, а другая - подвижной. Неподвижная фаза может быть твёрдым веществом, жидкостью, нанесённой на твёрдый носитель, либо гелем. Неподвижная фаза помещается в колонку, распределяется в виде тонкого слоя, плёнки и т.д. Подвижная фаза может быть газом, жидкостью или сверхкритическим газом (флюидом). Разделение основано на адсорбции, распределении, ионном обмене и т.д., либо на различиях в физико-химических свойствах молекул, таких как размер, масса, объём и т.д.

Данная глава содержит определения и расчёты общих параметров и применимых ко всем хроматографическим методам требований для пригодности системы. Принципы разделения, аппаратура и методики приводятся в следующих общих статьях:

Бумажная хроматография (2.2.26)

Тонкослойная хроматография (2.2.27)

Газовая хроматография (2.2.28)

Жидкостная хроматография (2.2.29)

Эксклюзионная хроматография (2.2.30)

Сверхкритическая флюидная хроматография (2.2.45)

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для расчёта пределов в монографиях использованы следующие определения.

При использовании некоторого оборудования ряд параметров, например отношение сигнал/шум, может быть рассчитано с помощью программного обеспечения, поставляемого производителем. На пользователе лежит ответственность за соответствие способов расчётов, используемых в программном обеспечении, требованиям Фармакопеи. В противном случае должны быть сделаны соответствующие исправления.

Хроматограмма

Хроматограмма представляет собой графическое или иное представление сигнала детектора на концентрацию веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, относительно времени, объёма или расстояния. Идеализированные хроматограммы представлены сочетанием гауссовских пиков и базовой линии (базовой линии).

ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ

Время удерживания и удерживаемый объём

Измерения удерживания в элюентной хроматографии могут быть представлены временем удерживания (tR), определённом непосредственно по положению максимума пика на хроматограмме. Из времени удерживания может быть рассчитан удерживаемый объём (VR).

V_R = t_Rv

tR - время удерживания или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту, v - объёмная скорость подвижной фазы.

Концентрационный коэффициент распределения

Концентрационный коэффициент распределения (Dm) (также известный как коэффициент ёмкости к' или фактор удерживания k) определяется как:

количество ■ вещества ■ в ■ неподвижной ■ фазе V_S

D_m = = K_c

количество ■ вещества ■ в ■ подвижной ■ фазе V_M

K_c - коэффициент распределения,

V_s - объём неподвижной фазы,

V_M - объём подвижной фазы.

Значение D_m компонента может быть определено из хроматограммы при использовании выражения:

^tM

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту,

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

Коэффициент распределения

Характеристика элюирования в эксклюзионной хроматографии может быть представлена коэффициентом распределения (K0), который рассчитывают с помощью выражения:

^tR ^-1 о

^K о =

^tt ^-1 о

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту,

t0 - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту,

tt - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту, который полностью проникает в поры неподвижной фазы.

Фактор удерживания (подвижности)

Фактор удерживания (подвижности R_F ), используемый в плоскостной хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы.

R_F = ^b

a

b - расстояние, пройденное веществом,

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Пик может быть охарактеризован площадью пика (A) или высотой пика (h) и шириной пика на половине высоты (w_h) или высотой пика (h) и шириной пика между точками перегиба (w). Для гауссовских пиков (Рисунок 2.2.46.-1) справедливо соотношение:

w_h = 1,18 w_t

Фактор асимметрии

Фактор асимметрии пика (A_s) (Рисунок 2.2.46.-2) рассчитывается из выражения:

_A = ^w0,05

^s 2d

wo,o5 - ширина пика на одной двадцатой высоты,

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика и передним краем пика на одной двадцатой высоты.

Если фактор ассиметрии равен 1,0 - это означает полную (идеальную) симметрию.

Эффективность колонки и число теоретических тарелок

Эффективность колонки, в зависимости от метода, может быть рассчитана из данных, полученных как при изотермическом, изократическом режимах, так и при режиме постоянной плотности, как число теоретических тарелок (n) из следующего выражения, в котором величины t_R и w_h должны быть выражены в одинаковых единицах (время, объём или расстояние).

2

N = 5,54

t

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту,

wh - ширина пика на половине высоты.

Число теоретических тарелок зависит удерживания.

от компонента, колонки и времени

ПАРАМЕТРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ Разрешение

Разрешение (R_s) близких по высоте пиков двух компонентов может быть рассчитано из выражения:

_R = l,18(tR2 - tRi)

t_Ri и t_R2 - времена удерживания или расстояния, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков,

w_h1 и w_h2 - ширина пиков на половине высоты.

Разрешение более 1,5 соответствует разделению пиков до базовой линии.

Выражение, приведенное выше, не может быть использовано в случае, когда пики сильно различаются по высоте.

В количественной плоскостной хроматографии вместо времён удерживания используются пройденные расстояния, и разрешение может быть рассчитано с использованием выражения:

_R \\8a(R_Pl -R_Pl)

R_F1 и R_F2 - отношения расстояний от точки нанесения пробы до центров пятен и расстояния, прошедшего фронтом растворителя от точки нанесения пробы (фактор подвижности),

w_h1 и w_h2- ширина пиков на половине высоты,

а - расстояние, прошедшее фронтом растворителя.

Коэффициент разделения пиков

Коэффициент разделения неполностью разделённых пиков (p/v-параметр) может быть использован в качестве требования пригодности хроматографической системы при выполнении испытания на родственные соединения в случае неполного отделения примеси от анализируемого вещества (аналита) (Рисунок 2.2.46.-3).

p / v = ^

Hp - высота пика примеси относительно экстраполированной базовой линии,

Относительное удерживание

Относительное удерживание (г) рассчитывается из выражения:

Hv - расстояние между экстраполированной базовой линией и нижней точкой кривой, разделяющей пики примеси и аналита.

tR₂ *_м r = —

t_R2 - время удерживания интересующего пика,

t_R1 - время удерживания пика сравнения (обычно пик, соответствующий исследуемому веществу),

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

В плоскостной хроматографии вместо tr2 и tr1 используются факторы подвижности

Rf2 и Rfi-

ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ (ПРЕЦИЗИОННОСТЬ) КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Отношение сигнал/шум

Отношение сигнал/шум (S/N) влияет на воспроизводимость (прецизионность) количественного определения и рассчитывается из уравнения:

S 2H

H - высота пика (Рисунок 2.2.46.-4), соответствующая рассматриваемому компоненту, на хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного раствора сравнения, измеренная от максимума пика до экстраполированной базовой линии для сигнала, величина которого эквивалентна двадцатикратному превышению величины ширины пика на половине высоты,

h - размах для фонового шума (уровень шума) на хроматограмме, полученной при введении или нанесении холостой пробы, величина которого эквивалентна двадцатикратному превышению щирины пика на половине высоты для пика на хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного раствора сравнения и, если возможно, расположенного на одном и том же расстоянии от места возможного обнаружения пика.

Сходимость (повторяемость)

Сходимость (повторяемость) отклика выражается в виде рассчитанного процентного относительного стандартного отклонения (RSD %) последовательных серий измерений с участием исследуемой пробы или раствора сравнения и рассчитывается из выражения:

I (У г - У)²

_{У 1}

n -1

y, - индивидуальные значения площади пика, высоты пика или отношения площадей в методе внутреннего стандарта,

У - среднее индивидуальных значений, n - число индивидуальных значений.

Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение (RSD_max) рассчитывается для серии измерений с участием исследуемой пробы или раствора сравнения для определённых пределов с использованием следующего выражения:

^RSDmax = ~

¹90%,n-1

K - константа (0,349), полученная из выражения

_v 0,6 ^t90%,5

в котором -⁰7⁶ соответствует требуемому RSD при 6 измерениях для B=1,0,

B - верхний предел, приведенный в определении в частной статье минус 100 процентов, предполагая, что верхний предел установлен согласно воспроизводимости методики,

n- число повторных измерений для раствора сравнения (3 < n < 6),

t₉₀%_n-1- коэффициент Стьюдента t для 90%-ной доверительной вероятности (двухсторонняя критическая область) с n - 1 степеней свободы.

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

Тесты на определение пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для того, чтобы удостовериться в адекватном функционировании хроматографической системы. Для оценки работы колонки обычно используются следующие параметры: эффективность, концентрационный коэффициент распределения, разрешение, относительное удерживание и фактор асимметрии.

На хроматографическое поведение могут влиять такие факторы, как состав, ионная сила, температура и рН подвижной фазы, скорость потока, длина колонки, температура, давление, а также характеристики неподвижной фазы: пористость, размер частиц, удельная площадь поверхности, а в случае обращённой фазы ­степень химической модификации (блокирование концевых групп, число атомов углерода и т.д.).

Различные компоненты используемого оборудования должны быть проверены на соответствие их качества и должны обладать точностью измерений требуемой для проведения испытания или количественного определения.

Должны быть соблюдены следующие требования при отсутствии других указаний в частной статье.

• Величина фактора асимметрии основного пика должна находиться в пределах от 0,8 до 1,5, если только нет иных указаний в частной статье. Данное требование распространяется как на тесты, так и на количественные определения, описанные в частных статьях.

• Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение для повторных измерений для предписанного раствора сравнения не должно превышать величин, приведенных в Таблице 2.2.46.-1. Данное требование распространяется только на количественное определение вещества и не используется в случае проведения испытания на родственные соединения.

• Предел обнаружения пика (соответствующий отношению сигнал/шум равному 3) находится ниже допустимого содержания примеси (порога, ниже которого присутствие примеси отрицается) в тесте на родственные соединения.

- Предел количественного определения пика (соответствующий отношению сигнал/шум равному 10) равен или меньше, чем порог обнаружения примесей (порог, при котором отрицается присутствие примеси) в тесте на родственные соединения.

Таблица 2.2.46.-1.

Требования к сходимости (повторяемости)

Число индивидуальных измерений (вводов проб)

3 4 5 6

B, % Максимальное допустимое относительное стандартное

отклонение

2,0 0,41 0,59 0,73 0,85

2,5 0,42 0,74 0,92 1,06

3,0 0,62 0,89 1,10 1,27

РЕГУЛИРОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ

В качестве информации ниже приведены интервалы, в пределах которых могут изменяться различные параметры хроматографических испытаний, без принципиального изменения методики, для того, чтобы удовлетворять критериям пригодности системы. Описанные хроматографические условия были валидированы в процессе подготовки этой статьи. Проверка пригодности системы включена для того, чтобы гарантировать требуемое разделение для удовлетворительного проведения теста или количественного определения. Неподвижные фазы описаны только в общем виде, так как существует огромное количество их доступных коммерческих разновидностей, отличающихся по хроматографическому поведению и для того, чтобы достигнуть предписанных требований пригодности системы, в ряде случаев приходится вносить некоторые изменения в хроматографические условия. В методиках обращено-фазовой хроматографии, в особенности, регулирование различных параметров не всегда приводит к удовлетворительному разделению. В этом случае может возникнуть необходимость заменить одну колонку другой, обеспечивающей желаемое хроматографическое поведение, такого же типа (например, октадецилсиликагель), но от другого производителя.

Регулирование критических параметров для гарантии пригодности системы чётко указывается в частной статье.

Следует избегать множественных изменений условий, которые могут оказать совместное влияние на эффективность системы.

Тонкослойная и бумажная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30% (относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание), в зависимости от того, что больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ± 0,2 pH, если только иное не указано в частной статье, или ± 1,0 pH в случаях исследования нейтральных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%.

Наносимый объём: уменьшается на 20% от требуемого объёма при использовании пластинок с мелким размером частиц (2-10 мкм).

Расстояние перемещения фронта растворителя не должно быть меньше, чем 50 мм.

Жидкостная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30% (относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание) в зависимости от компонента, которого больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ±0,2 pH, при отсутствии других указаний в частной статье, или ±1,0 pH в случаях исследования нейтральных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%. Длина волны детектора: изменения не допускаются. Неподвижная фаза:

• длина колонки: ± 70%,

• внутренний диаметр колонки: ± 25%,

• размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается.

Скорость потока: ± 50%. Температура: ± 10%, максимум при 60°C.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что используемое детектирование и сходимость пика (пиков) остаются удовлетворительными.

Градиентное элюирование: конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, время удерживания или относительные удерживания, описанные в методике. Это может быть вызвано чрезмерной величиной объёма, между точкой встречи двух элюентов и входом в колонку.

Газовая хроматография

Неподвижная фаза:

• длина колонки: ±70%,

• внутренний диаметр колонки: ±50%,

• размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается,

• толщина плёнки : от - 50% до + 100%.

Скорость потока: ±50%. Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

Сверхкритическая флюидная хроматография

Состав подвижной фазы: для набивных колонок количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30% (относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание), в зависимости от компонента, которого больше. Для капиллярной колонки изменения не допускаются.

Длина волны детектора: изменения не допускаются.

Неподвижная фаза:

• длина колонки: ±70%,

• внутренний диаметр колонки: ±25% (набивные колонки), ±50% (капиллярные колонки),

• размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается (набивные колонки).

Скорость потока: ±50%.

Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Метод внешнего стандарта. Концентрация анализируемого компонента (компонентов) определяется путём сравнения сигнала (сигналов) (пика (пиков)), полученного для исследуемого раствора, и сигнала (сигналов) (пика(пиков)), полученного для раствора сравнения.

Метод внутреннего стандарта. В исследуемый раствор и раствор сравнения вводятся одинаковые количества компонента (внутреннего стандарта), который разделяется с исследуемым веществом и не взаимодействует с ним. Концентрация исследуемого вещества определяется путём сравнения отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту, для анализируемого раствора и отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту, для раствора сравнения.

Методика нормализации. Процентное содержание одного или большего числа компонентов исследуемого вещества рассчитывается путём определения площади пика или пиков, как процентной части общей площади всех пиков, исключая пики, соответствующие растворителям или любым добавленным реагентам и тем веществам, содержание которых ниже допустимого предельного содержания.

Методика градуировки. Определяют связь между измеренным или рассчитанным сигналом (y) и количеством (концентрацией, массой и т.д.) определяемого вещества (x) и рассчитывают уравнение градуировочной функции. Аналитические результаты рассчитывают из измеренного или рассчитанного сигнала с помощью обратной функции.

Для количественных определений основного вещества и компонентов в частных статьях обычно используются методы внешнего и внутреннего стандартов или методика градуировки; методика нормализации обычно не применяется. При проведении испытаний на родственные соединения обычно применяют метод внешнего стандарта с одним раствором сравнения либо методику нормализации. Вместе с тем, при использовании как методики нормализации, так и метода внутреннего стандарта, в случае если для сравнения используются разбавления исследуемого раствора, сигналы для родственных веществ должны быть близки к сигналу самого вещества (фактор соответствия от 0,8 до 1,2), в противном случае в тесте должны быть указаны величины поправочных факторов, обратных факторам соответствия.

Фактор соответствия представляет собой относительную величину, равную соответствию равных масс родственных веществ при условиях, описанных в тесте.

Если испытание на родственные соединения предписывает определение общего содержания примесей либо подразумевает количественное определение примеси, важно выбрать подходящую величину порога и подходящие условия сложения площадей пиков. В таких испытаниях допустимый предел, т.е. площади пиков, которые лежат ниже предела и не принимаются во внимание, обычно равен 0,05%. Таким образом, пороговая величина в случае сложения величин соответствует, по крайней мере, половине допустимого предела. Сложение площадей пиков примесей, которые не полностью разделяются с основным пиком, лучше всего проводить экстраполяцией. Пики, соответствующие растворителям, используемым для растворения образца, также не принимаются во внимание.