2.2.39. Молекулярно-массовое распределение декстранов

Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (2.2.30).

Испытуемый раствор. 0,200 г испытуемой субстанции растворяют в подвижной фазе и доводят объем раствора этим же растворителем до 10 мл.

Маркерный раствор. 5 мг глюкозы Р и 2 мг декстрана V_o ФСО растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Градуировочные растворы. Навеску каждого из указанных стандартных образцов: 15 мг декстрана 4 для градуировки ФСО, 15 мг декстрана 10 для градуировки ФСО, 20 мг декстрана 40 дляградуировки ФСО, 20 мг декстрана 70 для градуировки ФСО и 20 мг декстрана 250 для градуировки ФСО отдельно растворяют в 1 мл подвижной фазы.

• Возможно использование стандартных образцов декстранов для градуировки с другими паспортными данными М_w, в этом случае для градуировки хроматографической системы рекомендуется использовать дополнительно еще не менее двух стандартных образцов декстранов.

• Условия хроматографирования как, например, размер и количество колонок, тип сорбента, состав и скорость подвижной фазы, объем вводимой пробы и другие параметры, указываются в частных статьях и могут варьировать. При этом должны выполняться требования к градуировке и условия теста «Проверка пригодности хроматографической системы»

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. 20 мг декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы ФСО (для анализа субстанции декстрана 40) или 20 мг декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы ФСО (для анализа субстанций декстрана 60 и декстрана 70) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Хроматографирование может быть проведено на хроматографе с дифференциальным рефрактометрическом детектером при следующих условиях:

• колонка, заполненная агарозой поперечно-сшитой для хроматографии Р или серий колонок размером 0,3 м х 10 мм каждая, заполненные полиэфирным гидроксилованным гелем для хроматографии Р;

• подвижная фаза: раствор 7 г натрия сульфата безводного Р и 1 г хлорбутанола Р в 1 л воды Р;

• скорость подвижной фазы от 0,5 мл/мин до 1 мл/мин, поддерживаемая постоянно с точностью +1% в час;

• петлевой дозатор с объемом петли от 100 мкл до 200 мкл;

• температура системы поддерживается постоянной с точностью +0,1 ^оС.

ГРАДУИРОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют несколько раз выбранный объем маркерного раствора. На хроматограмме должны присутствовать два пика: первый пик соответствует декстрану Vcj ФСО, второй пик соответствует декстрозе (глюкозе) Р. Исходя из объема элюирования декстрана V,, рассчитывают объем эксклюзии V,; полный объем Vt рассчитывают по пику, соответствующему глюкозе.

Хроматографируют определенный объем каждого из градуировочных растворов. Для каждой полученной хромотограммы проводят базовую линию, обращая внимание на правильнойть определения начала и конца пика. Каждую хроматограмму делят вертикальными равноудаленными линиями на р секций (количеством не менее 60), что соответствует равным объемам элюирования. Для каждой секции /, соответствующей объему элюирования V, измеряют высоту (у,) от базовой линии до линии хроматограммы и рассчитывают коэффициенты распределения (К) по формуле:

К = ^{{V -Vo)}, (1)

где:

Vo - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему декстрану Vo ФСО на хроматограмме маркерного раствора ;

Vt - полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на хроматограмме маркерного раствора;

V/ - объем элюирования для секции /, полученный для хроматограммы каждого из градуировочных растворов.

Градуировку проводят, используя один из следующих методов.

Градуировка по градуировочному графику. По уравнению (1) для каждого из декстранов для градуировки рассчитывают коэффициент распределения K_max, соответствующий максимальной высоте пика хроматограммы. На полулогарифмической бумаге строят зависимость значений K_max (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты пика (M_max) каждого из декстранов для градуировки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят первую градуировочную линию, экстраполируя ее из точки K_max, полученной для декстрана 250 для градуировки ФСО, до более низких значений К, полученных для тех же стандартных растворов (см. Рис. 2.2.39.-1).

Рис. 2.2.39.1. Пример градуировочного графика Пунктиром указана часть градуировочного графика, полученная экстраполированием. Горизонтальными линиями в нижней части рисунка указаны ширина и положения хроматографических линий, полученных для каждого декстрана для градуировки

Используя полученный первый градуировочный график, находят для всех значений К для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс М, получая в таком способе графическую зависимость для рассчета молекулярно-массового распределения. Для всех декстранов для градуировки расчитывают среде массовую молекулярную массу М_ю по уравнению (3), приведенному ниже. Градуировочный график может быть использован для расчетов, если расчеты значения М_ю для каждого из декстранов для градуировки не отличаются от указанных в паспорте значений больше чем на 5% и средние отклонения для всех декстранов не превышает +3%. Если данные условия не выполняются, градуировочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные операции пока рассчитанные и указанные в паспорте значения М_ю будут отличаться не более чем на 5%.

Градуировка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и (3), приведенных ниже, и подходящего метода (возможно использование итеративного метода Гаусса-Ньютона, модифицированного метода Хартли. Также возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые используют принцип нелинейного регрессивного анализа) рассчитывают значения коэффициентов b₁, b₂, b₃, b₄ и b₅, для которых полученные значения М_ю могут отличаться не более чем на 5% от соответственных паспортных значений М_ю для каждого декстрана для калибровки и должны быть 180+2 для глюкозы.

# При расчетах М_ю глюкозы в уравнении (2) допускают К=1.

„, , (b₄ +h-K +b₂ К² +b₃K³)

Mi = b5 + е ^{4 1 2}

_{_ t (УМ)}

_{M w = ,}

^p (3)

i=1

_ t (y_tM_t)

M w = ,

ⁿ (4)

_t ^y_i

i=1

где:

р - число секций, на которые поделена хроматограмма;

у: - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;

М_; - молекулярная масса для секции /.

ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют выбранный объем соответствующего раствора для проверки пригодности хроматографической системы.

Средняя молекулярная масса декстрана для проверки пригодности ФСО. Рассчитывают значение М_ю, как указано в разделе «Градуировка хроматографической системы» используя или градуировочный график, или значения коэффициентов b₁, b₂, b₃, b₄ и b₅. Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение М_ю находится в пределах:

• от 41000 до 47000 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);

• от 67000 до 75000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).

Средняя молекулярная масса 10% высокомолекулярной фракции декстрана. Значение М_w для 10% высокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях от 1 до n включительно, рассчитывают по формуле:

_ t (УМ )

М w = ^=

(4)

i=1

где:

n - номер секции, для которой выполняются неравенства:

n f P ^

i=1 V i=1 0

n+1 f p ^

_{t Уг > ОД t Уг}

i=1 V i =1 0

(6)

где:

р - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

у_; - высота хроматографической линии над базовой линией для секции /;

М_; - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение М_w для 10% высокомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

• от 110000 до 130000 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);

• от 190000 до 230000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).

Средняя молекулярная масса 10% низкомолекулярной фракции декстрана.

Значение М_w для 10% низкокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях хроматограмм от секции р до секции m включительно, рассчитывают по формуле:

_{t (УгМг )}

М,

_t ^y_i

(7)

i=m

где:

m - номер секции, для которой выполняются неравенства:

_{t yi < 0,1 t yi}

i = m V i =1 0

p f p

t yi > 0,1 t yi

i = m -1 V i =1 0

(8)

(9)

где:

р - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

у_; - высота хроматографической линии над базовой линией для секции /;

М_; - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение М_w для 10% низкомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

• от 6000 до 8500 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);

• от 7000 до 11000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).

• Параллельно с раствором проверки пригодности хроматографической системы хроматографируют также маркерный раствор.

• Для получения более надежных результатов в частных статьях рекомендуется регламентировать такие отношения сигнал/шум, степень разделения пиков декстрана 40 и глюкозы, эффективность пика глюкозы и близость расчета М_ю для повторных хроматограмм для проверки пригодности хроматографической системы.

МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ДЕКСТРАНА

Хроматографируют выбранный объем испытуемого раствора и значение М_ю для молекулярно-массового распределения декстрана, значение М_w для 10% высокомолекулярной фракции декстрана и значение М _w для 10% низкомолекулярной фракции декстрана, рассчитывают, как описано в разделе «Пригодность хроматографической системы».

• Параллельно с испытуемым раствором хроматографируют маркерный раствор.

• Полученные результаты молекулярно-массового распределения округляют до 10 значащих единиц.

• В настоящей документации к декстранам для градуировки ФСО и к декстрану для проверки пригодности ФСО приводятся паспортные значения средне массовой молекулярной массы М _w, значения молекулярной массы в максимуме пика, а также пределы для средней молекулярной массы, средней молекулярной массы для 10% высокомолекулярной фракции декстрана и средней молекулярной массы для 10% низкомолекулярной фракции декстрана.