2.2.30. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография представляет собой хроматографический метод, в котором процесс распределения молекул в растворе происходит в соответствии с их размерами. В случае использования органической подвижной фазы метод называют гель-проникающей хроматографией, а в случае использования водной подвижной фазы - гель-фильтрационной хроматографией. Проба вводится в колонку, заполненную гелем или пористыми частичками наполнителя, и переносится подвижной фазой через колонку. Распределение в соответствии с размерами происходит в процессе движения и многоразовых обменов молекул растворенного вещества между молекулами растворителя (подвижной фазы) и тем же самым растворителем, находящимся в порах материала, которым заполнена колонка. Диапазон размеров распределенных молекул определяется диапазоном размеров пор наполнителя.

Достаточно маленькие молекулы, способные проникать во все поры материала, элюируются в полном объеме колонки (V_t - полный проникающий объем или граница эксклюзии). Молекулы с размерами, превышающими размер всех пор материала колонки, мигрируют лишь сквозь простор между частицами наполнителя, не препятствуя им, и элюируются в свободном объеме колонки (Vo - объем эксклюзии или мертвый объем). Распределение молекул в соответствии с размерами происходит между свободным объемом и полным объемом колонки; наиболее эффективное распределение происходит в первые две трети даного диапазона.

Оборудование. Специфичной частью оборудования является хроматографическая колонка подходящих размеров, заполненная материалом, который обеспечивает распределение молекул соответствующих размеров в необходимом диапазоне. Если необходимо, колонку термостатируют. Через колонку с постоянной скоростью пропускают элюент. К одному концу колонки обычно присоединяют приспособление для введения пробы, например, инжектор с прерывателем потока, шприцевой инжектор с мембраной для введения пробы без приостановки потока или петлевой инжектор с клапаном, который перекрывает поток. К этому же концу колонки также может быть присоединен соответствующий насос для подачи элюента с контролируемой скоростью. Проба может также наноситься непосредственно на сухую поверхность материала колонки или, если вязкость пробы превышает вязкость элюента, проба может наслаиваться на поверхность материала колонки под элюент. Другой конец колонки обычно присоединяют к соответствующему детектору с приспособлением, регистрирующим и обеспечивающим контроль соответствующих концентраций распределенных компонентов пробы. Обычно используют детекторы: фотометрический, рефрактометрический или люминесцентный. При необходимости, может быть присоединен автоматический коллектор фракций.

В качестве наполнителя может использоваться или мягкий материал, такой как набухший гель, или твердый, такой как пористое стекло, силикагель или подходящий для данного растворителя поперечно-сшитый органический полимер. При использовании твердых материалов обычно применяют принудительную подачу подвижной фазы под давлением, что ускоряет разделение. Подвижную фазу выбирают исходя из природы пробы, наполнителя и метода детектирования.

Указания по обработке материала для заполнения колонки перед выполнением распределения и наполнения колонки представлены в соответствующей частной статье или инструкции изготовителя.

# Условия хроматографирования, такие, например, как размер колонки, скорость подвижной фазы, объем вводимой пробы и другие параметры, обозначенные в частной статье, не являются строго регламентированными и могут варьировать. При этом должны выполняться условия теста «Пригодность хроматографической системы» (2.2.46), и данный тест может учитывать влияние таких изменений на полученные результаты.

Определение относительного компонентного состава смесей

Распределение проводят, как описано в частной статье. При возвожности записывают хроматограмму, полученную в процессе распределения, и измеряют площадь соответствующих пиков. Если чувствительность одинаковая для всех компонентов пробы (например, они имеют одинаковое удельное оптическое поглощение), относительное содержание каждого компонента рассчитывают как отношение площади пика соответствующего компонента к сумме площадей пиков всех компонентов. Если для разных компонентов пробы чувствительность разная, содержание каждого компонента рассчитывают с помощью градуировочных графиков, полученных с использованием соответствующих стандартных веществ для градуировки, как указано в частной статье.

Определение молекулярных масс

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярных масс веществ путем сравнения с соответствующими стандартными веществами для градуировки, указанными в частной статье.

Для молекулярных масс стандартных веществ строят график зависимости объема удерживания от логарифма молекулярных масс.

График, выстроенный в пределах, ограниченных значениями объема эксклюзии и полного объема проникновения обычно приближается к прямой линии для данной колонки в данных экспериментальных условиях. На основании этого графика могут быть рассчитаны молекулярные массы. Использование метода градуировки для молекулярно-массового разделения позволяет получать достоверные результаты лишь для частных случаев систем высокомолекулярное вещество/растворитель в описанных экспериментальных условиях.

Определение молекулярно-массового рапределения полимеров

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярно-массового распределения полимеров. Однако сравнить между собой результаты можно лишь в одинаковых экспериментальных условиях. Стандартные вещества, используемые для градуировки, и методики анализа описывают в соответствующих частных статьях.