- •Государственная фармакопея республики беларусь первое издание
- •Республики Беларусь
- •1. Общие сведения
- •1.1. Общие положения
- •1.2. Другие положения, распространяющиеся на общие и частные фармакопейные статьи
- •Условия хранения лекарственного средства
- •Пределы, указываемые на упаковке
- •1.5. Сокращения и обозначения
- •1.6. Единицы международной системы (си), используемые в фармакопейных статьях, и их соответствие другим единицам
- •2. Методы анализа
- •2.1. Оборудование
- •2.1.1. Каплемер
- •2.1.2. Сравнительная таблица пористости стеклянных фильтров
- •Пористость фильтра (ф.Евр.) (1)
- •Максимальный диаметр пор в микрометрах
- •2.1.3. Лампы с ультрафиолетовым излучением для аналитических целей
- •2.1.4. Сита
- •2.2. Физические и физико-химические методы
- •2.2.1. Определение прозрачности и степени мутности жидкостей
- •2.2.2. Определение степени окрашивания жидкостей
- •2.2.3. Потенциометрическое определение рН
- •2.2.4. Зависимость между реакцией раствора, приблизительным значением рН и цветом индикаторов
- •Изменение цвета
- •2.2.5. Относительная плотность
- •2.2.6. Показатель преломления (индекс рефракции)
- •2.2.7. Оптическое вращение
- •2.2.8. Вязкость
- •1/Прив 1
- •2.2.9. Метод капиллярной вискозиметрии
- •2.2.10. Метод ротационной вискозиметрии
- •2.2.11. Температурные пределы перегонки
- •2.2.14. Температура плавления - капиллярный метод
- •2.2.17. Температура каплепадения
- •2.2.18. Температура затвердевания
- •2.2.21. Флуориметрия
- •2.2.22. Атомно-эмиссионная спектрометрия
- •2.2.23. Атомно-абсорбционная спектрометрия
- •2.2.24. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной
- •2.2.25. Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой видимой областях
- •2. Многокомпонентный спектрофотометрический анализ.
- •2.2.26. Бумажная хроматография
- •2.2.27. Тонкослойная хроматография
- •2.2.28. Газовая хроматография
- •2.2.29. Жидкостная хроматография
- •2.2.30. Эксклюзионная хроматография
- •2.2.31. Электрофорез
- •2.2.32. Потеря в массе при высушивании
- •2.2.33. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса
- •2.2.34. Термогравиметрия
- •2.2.35. Осмоляльность
- •2.2.36. Потенциометрическое определение концентрации ионов с использованием ионселективных электродов
- •2.2.37. Рентгенофлуоресцентная спектрометрия
- •2.2.38. Удельная электропроводность
- •2.2.39. Молекулярно-массовое распределение декстранов
- •2.2.40. Спектрофотометрия ближнего ик-диапазона
- •2.2.41. Круговой дихроизм
- •2.2.42. Плотность твердых тел
- •2.2.43. Масс-спектрометрия
- •2.2.44. Определение содержания общего органического углерода в воде для фармацевтического применения
- •2.2.45. Сверхкритическая флюидная хроматография
- •2.2.46. Хроматографические методы разделения
- •2.2.47. Капиллярный электрофорез
- •2.2.48. Рамановская спектрометрия (# спектрометрия комбинационного рассеяния)
- •2.2.54. Изоэлектрическое фокусирование
- •2.3.1. Реакции подлинности (идентификации) на ионы и функциональные группы
- •2.3.2. Идентификация жирных масел методом тонкослойной хроматографии
- •2.3.3. Идентификация фенотиазинов методом тонкослойной хроматографии
- •2.3.4. Определение запаха
- •2.4. Испытания на предельное содержание примесей
- •2.4.1. Аммония соли
- •2.4.2. Мышьяк
- •2.4.3. Кальций
- •2.4.6. Магний
- •2.4.7. Магний и щелочноземельные металлы
- •2.4.8. Тяжелые металлы
- •2.4.15. Никель в полиолах
- •2.4.1.6. Общая зола
- •2.4.21. Посторонние масла в жирных маслах методом тонкослойной хроматографии
- •2.4.22. Посторонние жирные кислоты в маслах методом газовой хроматографии
- •2.4.23. Стерины в жирных маслах
- •2.4.24. Идентификация остаточных растворителей и их количественное определение
- •2.4.25. Остаточные количества этиленоксида и диоксана
- •2.4.27. Никель в гидрогенизированных растительных маслах
- •2.5. Методы количественного определения 2.5.1. Кислотное число
- •2.5.3. Гидроксильное число
- •2.5.4. Йодное число
- •2.5.5. Перекисное (пероксидное) число
- •2.5.6. Число омыления
- •2.5.7. Неомыляемые вещества
- •2.5.8. Определение аминного азота в соединениях, которые содержат первичную ароматическую аминогруппу
- •2.5.9. Определение азота после минерализации серной кислотой
- •2.5.10. Метод сжигания в колбе с кислородом
- •2.5.11. Комплексометрическое титрование
- •2.5.12. Вода: полумикрометод (#Метод к.Фишера)
- •2.5.13. Алюминий в адсорбированных вакцинах
- •2.5.14. Кальций в адсорбированных вакцинах
- •2.5.20. Гексозамины в полисахаридных вакцинах
- •2.5.21. Метилпентозы в полисахаридных вакцинах
- •2.5.24. Диоксид углерода в газах
- •2.5.25. Оксид углерода в газах
- •2.5.26. Оксид азота и диоксид азота в газах
- •2.5.27. Кислород в газах
- •2.5.30. Окисляющие вещества
- •2.5.33. Общий белок
- •2.5.34. Уксусная кислота в синтетических пептидах
- •2.6. Биологические испытания
- •2.6.1. Стерильность
- •2.6.2. Микобактерии
- •2.6.3. Испытания на посторонние вирусы с использованием куриных эмбрионов
- •2.6.4. Испытание на вирусы лейкоза
- •2.6.5. Испытание на посторонние вирусы с использованием клеточных культур
- •2.6.6. Испытание на посторонние агенты с использованием цыплят.
- •2.6.7. Микоплазмы
- •2.6.8 Пирогенность
- •2.6.9. Аномальная токсичность
- •2.6.10. Гистамин
- •2.6.11. Депрессорные вещества
- •2.6.12. Микробиологические испытания нестерильной продукции (суммарное количество жизнеспособных аэробов)
- •2.6.13. Микробилогические испытания нестерильной продукции (испытания на наличие специфических микроорганизмов)
- •0,9 % Раствор натрия хлорида
- •1 % Раствор фенолового красного
- •0,5 % Раствор малахитового зеленого
- •2.6.14. Бактериальные эндотоксины
- •1. Предварительные испытания
- •2. Предельное испытание (метод а) (I) Методика
- •2. Полуколичественное испытание (метод в)
- •1. Турбидиметрический принцип (методы с и f)
- •2.6.15. Активатор прекалликреина
- •2.6.16. Испытания на посторонние агенты в вирусных вакцинах для медицинского применения
- •2.6.17. Испытание на антикомплементарную активность иммуноглобулина
- •2.6.18. Испытание живых вирусных вакцин на нейровирулентность
- •2.6.19. Испытание пероральной вакцины полиомиелита на нейровирулентность
- •5.1. Предотвращение загрязнения
- •5.4 Детектирование
- •7.1 Валидация системы для количественного определения методом
- •7.2. Контроль качества реагентов.
- •7.3. Контроль хода испытания.
- •7.4. Внешняя оценка качества
- •2.6.22. Активированные факторы свертывания крови
- •2.7 Биологические методы количественного определения
- •2.7.1. Иммунохимические методы
- •2.7.2. Количественное определение антибиотиков микробиологическим методом
- •2.7.3. Количественное определение кортикотропина
- •2.7.4. Количественное определение фактора свертывания крови VIII
- •2.7.5. Количественное определение гепарина
- •2.7.6. Количественное определение вакцины дифтерии (адсорбированной)
- •2.7.7. Количественное определение вакцины коклюша
- •2.7.8. Количественное определение вакцины столбняка (адсорбированной)
- •2.7.9. Определение функционального состояния Fc-фрагмента иммуноглобулина
- •2.7.10. Количественное определение фактора свертывания крови человека VII
- •2.7.11. Количественное определение фактора свертывания крови человека IX
- •2.7.12. Количественное определение гепарина в концентратах
- •2.7.13. Количественное определение человеческого анти-d-иммуноглобулина
- •2.7.14. Количественное определение антигенной (иммуногенной) активности вакцины гепатита а
- •2.7.15. Количественное определение вакцины гепатита в (rdna)
- •2.7.16. Количественное определение вакцины коклюша (бесклеточной)
- •2.7.17. Количественное определение антитромбина III человека
- •2.7.18. Количественное определение фактора свертывания крови II
- •2.7.19. Количественное определение фактора свертывания крови х
- •2.7.20. Количественное определение инактивированной вакцины полиомиелита in vivo
- •2.7.22. Количественное определение фактора свертывания крови человека XI
- •2.8. Методы анализа лекарственного растительного сырья и лекарственных средств из него
- •2.8.1. Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте
- •2.8.4. Коэффициент набухания
- •2.8.5. Определение воды в эфирных маслах
- •2.8.10. Растворимость эфирных масел в спирте
- •2.8.11. Определение 1,8-цинеола в эфирных маслах
- •2.8.12. Определение эфирного масла
- •2.8.13. Остаточное количество пестицидов
- •1. Экстракция
- •2. Очистка
- •3. Количественный анализ
- •Относительные времена удерживания инсектицидов
- •2.8.15. Определение показателя горечи
- •2.8.16. Сухой остаток экстрактов
- •2.8.17. Потеря в массе при высушивании экстракта
- •2.9. Фармацевтико-технологические испытания
- •2.9.1. Распадаемость таблеток и капсул
- •2.9.2. Распадаемость суппозиториев и пессариев
- •2.9.3. Тест «растворение» для твердых дозированных форм
- •2.9.4. Тест «растворение» для трансдермальных пластырей
- •2.9.5. Однородность массы для единицы дозированного лекарственного средства
- •2.9.6. Однородность содержания действующего вещества в
- •2.9.7. Прочность таблеток без оболочки на истирание
- •2.9.8. Прочность таблеток на сжатие
- •2.9.9. Измерение консистенции методом пенетрометрии
- •2.9.10 Содержание этанола
- •2.9.11. Испытание на содержание метанола и 2-пропанола
- •2.9.12. Ситовой анализ
- •2.9.15. Насыпной объем
- •2.9.16. Сыпучесть
- •2.9.17. Определение извлекаемого объема парентеральных лекарственных средств
- •Масса действующего вещества высвобожденного при опорожнении
- •Фракция действующего вещества (%)
- •2.9.19. Загрязнение механическими включениями: невидимые частицы.
- •2.9.20. Загрязнение механическими включениями: видимые частицы
- •2.9.21. Загрязнение механическими включениями: метод микроскопии
- •2.9.22. Опредление времени деформации липофильных суппозиториев
- •2.9.23. Определение плотности твердых частиц при помощи пикнометра
- •2.9.24. Устойчивость суппозиториев и пессариев к разрушению
- •2.9.26. Опредедение удельной площади поверхности методом газовой адсорбции
- •III.1.3. Количество образца
- •III.2.1. Метод 1: метод динамического потока
- •III.2.2. Метод 2: метод объёмного анализа
- •2.9.27. Однородность массы одной дозы высвобожденной из многодозового контейнера
- •2.9.28. Определение массы или объема содержимого контейнера для жидких и мягких лекарственных средств
- •3.1. Материалы, используемые для производства контейнеров
- •3.1.1. Материалы, используемые для производства контейнеров для человеческой крови и компонентов
- •3.1.1.1. Материалы на основе пластифицированного поливинилхлорида, используемые для производства
- •3.1.1.2. Материалы на основе пластифицированного поливинилхлорида для трубок, используемых в комплектах для переливания крови и компонентов крови
- •3.1.3. Полиолефины
- •3.1.4. Полиэтилен без добавок для контейнеров для парентеральных и офтальмологических лекарственных средств
- •3.1.5. Полиэтилен с добавками для контейнеров для
- •3.1.6. Полипропилен для контейнеров и укупорочных материалов для парентеральных и офтальмологических лекарственных средств
- •3.1.7. Полиэтиленвинилацетат для контейнеров и трубок для лекарственных средств для парентерального питания
- •3.1.8. Силиконовое масло, используемое в качестве смазывающей добавки
- •3.1.9. Силиконовые эластомеры для укупорочных
- •3.1.10. Материалы на основе непластифицированного поливинилхлорида для контейнеров для неинъекционных водных растворов
- •3.1.11. Материалы на основе непластифицированного поливинилхлорида для контейнеров для твердых лекарственных форм для перорального применения
- •3.1.13. Добавки к пластмассе
- •3.1.14. Материалы на основе пластифицированного поливинилхлорида для контейнеров для водных растворов для внутривенного применения
- •3.1.15. Полиэтилентерефталат для контейнеров для лекарственных средств для непарентерального применения
- •3.2. Контейнеры
- •3.2.1. Стеклянные контейнеры для фармацевтического использования
- •3.2.2. Пластмассовые контейнеры и укупорочные средства для фармацевтического использования
- •3.2.2.1. Пластмассовые контейнеры для водных растворов для парентерального применения
- •3.2.3. Стерильные пластмассовые контейнеры для человеческой крови и ее компонентов
- •3.2.4. Пустые стерильные контейнеры из пластифицированного поливинилхлорида для человеческой крови и ее компонентов
- •3.2.5. Стерильные контейнеры из пластифицированного поливинилхлорида для человеческой крови, содержащие раствор антикоагулянта
- •3.2.6. Комплекты для переливания крови и компонентов крови
- •3.2.8. Стерильные одноразовые пластмассовые шприцы
- •3.2.9. Резиновые укупорочные средства для контейнеров, предназначенных для водных лекарственных средств для парентерального применения, порошков и лиофилизированных порошков
- •4. Реактивы
- •4.1. Реактивы, эталонные растворы, буферные растворы
- •4.1.1. Реактивы
- •4.1.2. Эталонные растворы для испытаний на предельное содержание примесей
- •0,1 М фосфатный буферный раствор рН 8,0. 4008400.
- •4.2. Реактивы, титрованные растворы для объемного нализа
- •1 М щелочной раствор меди-этилендиамина. 3008700
- •5.1 Общие тексты по стерилизации
- •5.1.1. Методы приготовления стерильных продуктов
- •5.1.2. Биологические индикаторы стерилизации
- •5.1.3. Эффективность антимикробных консервантов
- •24 Часа
- •5.1.4. Микробиологическая чистота лекарственных средств
- •5.1.5 .Применение f0 концепции при стерилизации паром водных растворов.
- •5.2. Общая информация о вакцинах
- •5.2.1. Общепринятая терминология
- •5.2.2. Стаи кур, не имеющих конкретных патогенов и используемые для производства вакцин и контроля их качества
- •5.2.3. Субстраты клеток для производства вакцин, используемых людьми
- •5.2.6. Оценка безопасности вакцин
- •5.2.7. Оценка эффективности вакцин
- •5.2.8. Снижение риска передачи возбудителей губчатой энцефалопатии через лекарственные средства
- •1. Общие замечания
- •2. Область применения общей главы
- •3.1. Животные как источник материала
- •3.2. Части тел животных, жидкости и выделения в качестве исходных материалов
- •3.3. Проверка процесса
- •5.3. Статистические методы обработки результатов анализа
- •5.3.1. Статистический анализ результатов биологических исследований и количественных определений
- •1.1. Общие положения и точность
- •2. Рандомизация и независимость конкретных исследований
- •3. Количественные определения, основанные на количественных эффектах
- •3.1. Статистические модели
- •3.2. Модель параллельных линий
- •3.2.2.1 Схема полной рандомизации
- •3.2.2.2 Схема рандомизированных блоков
- •3.3. Модель угловых коэффициентов
- •3.3.5.2 (/7С/)-схема
- •4. Тесты с альтернативным типом эффекта 4.1. Введение
- •4.2. Метод пробит-анализа
- •5.1. Модель параллельных линий.
- •5.2. Модель угловых коэффициентов
- •5.3. Альтернативные эффекты
- •6 Объединение результатов количественного определения 6.1. Введение
- •6.2. Взвешенное объединение результатов количественного определения
- •6.3. Невзвешенное объединение результатов количественного опре- деления
- •6.4. Пример определения взешенной средней активности с доверительн1м интервалом
- •7. Дополнение
- •7.1. Общие линейные модели
- •7.4. Ошибки корреляции
- •8. Таблицы и процедуры генерирования
- •8.5. Случайные размещения
- •8.6. Латинские квадраты
- •9. Принятые обозначения
- •1. Выборка
- •1.1. Среднее зна чение и дисперсия
- •1.3. Доверительные интервалы и оценка их величины.
- •1.4. Односторонние и двусторонние доверительные интервалы.
- •2. Метрологические характеристики методики анализа
- •2.1.1. Объединенная дисперсия и объединенное среднее
- •2.1.2. Критерий Бартлетта.
- •2.1.3. Критерий Кохрейна.
- •2.2. Проверка наличия значимой систематической погрешности.
- •3. Сравнение двух методик анализа по воспроизводимости
- •4. Метрологическая характеристика среднего результата.
- •5. Сравнение средних результатов двух выборок
- •5.3. Известно точное значение величины а.
- •6. Интерпретация результатов анализа, полученных с помощью метрологически аттестованной методики.
- •6.1. Оценка сходимости результатов параллельных определений.
- •6.2. Определение необходимого числа параллельных определений.
- •6.3. Гарантия качества продукции.
- •7. Расчет и статистическая оценка параметров линейной зависимости
- •8. Последовательная схема статистического анализа результатов химических измерений
- •9. Примеры
- •9.1 Вычисление среднего значения и дисперсии.
- •9.2 Проверка однородности выборки малого объема
- •9.3. Вычисление доверительных интервалов и неопределенностей измерений.
- •9.4. Проверка гипотезы равенства дисперсий.
- •9.4.1. Объединение результатов выборок разного объема.
- •9.4.2. Объединение результатов выборок одинакового объема.
- •9.5. Сравнение двух методик анализа по воспроизводимости.
- •9.6. Сравнение средних результатов двух выборок.
- •9.7. Оценка качества продукции.
- •9.8. Контроль содержания салициловой кислоты в салициловом спирте посредством секвенционального анализа.
- •10. Расчет неопределенности функции нескольких случайных переменных
- •10.1. Линейная модель
- •10.1.1. Взвешенное среднее
- •10.2. Подход Уэлча-Сатертуэйта
- •10.3. Примеры расчетов неопределенности функции нескольких переменных
- •10.3.1. Расчет неопределенности вэжх-анализа готового лекарственного средства
- •10.3.1.1. Конечная аналитическая операция
- •10.3.1.2. Суммарная неопределенность пробоподготовки asp,r.
- •10.3.1.3. Расчет суммарной неопределенности анализа aAs,r
- •10.3.2. Прогноз неопределенности спектрофотометрического анализа готового лекарственного средства
- •10.3.3. Расчет среднего значения нескольких неравноточных выборок
- •1. Введение
- •2. Аналитические испытания и методики, подлежащие валидации
- •3. Валидационные характеристики и требования
- •4. Словарь
- •2. Специфичность
- •5. Правильность
- •5.1. Количественное определение
- •5.2. Примеси (количественное содержание).
- •7. Предел обнаружения
- •8. Предел количественного определения
- •8.3. Использование калибровочной прямой и стандартного отклонения сигнала
- •9. Робастность
- •10. Проверка пригодности хроматографической системы
- •3. Неинструментальные испытания на чистоту и предельное содержание примесей
- •5. Разделительные методы
- •6.1. Метод добавок
- •6.2. Сравнение с арбитражным методом
- •5.4. Остаточные количества органических растворителей
- •5.4.1. Введение
- •5.4.2. Область применения
- •5.4.3. Общие положения
- •5.4.4. Предельные содержания остаточных растворителей
- •5.5. Алкоголеметрические таблицы
- •5.6. Отчет об исследовании интерферонов
- •3.3. Процедура исследования
- •3.3.1. Определение уровня доза-ответ
- •5.7. Таблица физических упоминаемых в фармакопеи
- •Вероятность эмиссии
- •Энергия (мЭв)
- •Энергия (мЭв)
- •Вероят ность эмиссии (на
- •Энергия (мЭв)
- •Вероятность эмиссии
- •5.8. Биодоступность и биоэквивалентность генерических лекарственных средств
- •3. Регистрационная оценка взаимозаменяемых лекарственных
- •4. Исследования эквивалентности, необходимые для
- •4.2.1. Исследования биоэквивалентности/биодоступности (исследования на человеке)
- •4.2.2. Общие методические подходы к выполнению исследований биоэк- вивалентности/биодоступности
- •4.2.3. Исследования сравнительной кинетики растворения (исследования вне живого организма)
- •4.3. Отсутствие необходимости в исследованиях биоэквивалентности или биодоступности
- •5. Дизайн и проведение исследований биологической эквивалентности и биодоступности на людях 5.1. Общие требования.
- •5.2. Испытуемые
- •6. Регламент фармакокинетического исследования
- •7. Аналитический метод
- •8. Анализ фармакокинетических данных
- •8.1. Параметры, подлежащие оценке
- •8.1.1. Однократное введение лекарственного средства
- •8.1.2. Многократное введение лекарственного средства
- •9. Исключение резко выделяющихся наблюдений
- •12. Фармакодинамические исследования
- •13. Клинические испытания
- •14. Тест сравнительной кинетики растворения in vitro
- •15. Клинически значимые колебания биодоступности, обуславливающие отказ в регистрации лекарственного средства
- •Лабораторных животных
- •Участие в испытаниях биоэквивалентности/биодоступности
- •Номограмма для определения достаточного числа добровольцев по результатам проведенного исследования.
- •Хорошо растворимые лекарственные средства
- •Средства с высокой степенью абсорбции
- •Перечень терапевтических (лечебных) доз средств на основе лекарственного растительного сырья
- •Основная литература
- •6. Общие статьи на лекарственные формы и субстанции
2. Рандомизация и независимость конкретных исследований
Применение различных методов воздействий к различным экспериментальным объектам (животные, пробирки и т.д.) должно быть осуществлено определенным строго случайным образом. Любой другой выбор экспериментальных условий, который преднамеренно не учитывается в плане эксперимента, также должен быть выполнен случайным образом. Например, выбор размещения боксов в лаборатории и порядок проведения исследований. В частности, группа животных, получающих одинаковую дозу какого-нибудь препарата, не должна одновременно подвергаться исследованию (в то же самое время или в том же самом месте), до тех пор, пока не будет весомых доказательств того, что источник вариации (например, между временем или между положениями) является незначительным. Рандомизация может быть осуществлена с использованием компьютера при помощи встроенной функции случайных чисел. Каждый раз, после запуска программы аналитик должен убедиться, что генерируется новая последовательность случайных чисел.
Препараты, назначаемые каждому экспериментальному объекту, должны быть настолько независимы, насколько это возможно. В пределах каждой экспериментальной группы, разведения, назначенные каждой группе, должны быть не просто разведениями одной и той же дозы, но и должны быть приготовлены индивидуально. Без выполнения данного условия, вариабельность, свойственная препарату, не будет полностью представлена в дисперсии ошибки эксперимента. В результате будет недооценена не-исключенная погрешность, что может привести к:
необоснованному ужесточению исследования при дисперсионном анализе (см. Разделы 3.2.3 и 3.2.4);
недооценке действительных доверительных интервалов при испытании, которые, как показано в Разделе 3.2.5, рассчитаны исходя из оценки s2 (средний квадрат не-исключенной ошибки).
3. Количественные определения, основанные на количественных эффектах
3.1. Статистические модели
3.1.1 ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
Количественные определения биологической активности, включенные в Фармакопею, основаны на «принципе разведения». Это означает, что анализируемый испытуемый препарат предположительно содержит то же самое активное вещество, что и стандартный препарат, но отличается от последнего соотношением активного и неактивного компонентов. В этом случае испытуемый препарат можно теоретически получить из стандартного путем его разведения неактивными компонентами. Для того, чтобы проверить, подчиняется ли какой-либо конкретный тест количественного определения «принципу разведения», необходимо сравнить зависимость доза-эффект стандартного и испытуемого препаратов. Если эти зависимости различаются статистически значимо, то теоретическая модель «принципа разведения» не является достоверной. Статистически значимые различия в зависимостях доза-эффект для стандартного и испытуемого препаратов позволяют предположить, что один из препаратов, кроме активного компонента, содержит другие компоненты, которые обладают активностью или влияют на измеряемые результаты.
Для того, чтобы в теоретической модели достигнуть более выраженного эффекта разведения, следует преобразовать зависимость доза-эффект в линейную функцию в наибольшем возможном интервале доз. В качестве модели для рассматриваемых количественных определений биологической активности интерес представляют две модели: модель параллельных линий и модель угловых коэффициентов.
Применение той или иной модели зависит от выполнения следующих условий:
различные воздействия у экспериментальных объектов были выполнены случайным образом;
результаты каждого исследования подчиняются закону нормального распределения;
стандартные отклонения эффектов в каждой исследуемой группе, как для стандартного, так и для испытуемого препаратов, статистически не отличаются друг от
друга.
При разработке методики количественного определения, аналитик должен убедиться, что полученные данные от различных количественных определений удовлетворяют этим теоретическим условиям.
Условие 1 может быть выполнено при помощи использования Раздела 2.
Условие 2 является предположением, которое на практике почти всегда выполняется. Незначительные отклонения от этого предположения, в основном, не вносят серьезных ошибок в анализ, поскольку исследование включает несколько повторений. В случае сомнения, может быть выполнена проверка на нормальность (например, при помощи критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk)1).
Для проверки выполнения Условия 3 могут быть использованы тесты проверки однородности дисперсий (например, критерий Бартлетта (Bartlett)2, критерий Кокрена (Cochrane)3). Для этих целей также может быть использовано графическое представление результатов анализа (см. примеры в Разделе 5).
Если условия 2 и/или 3 не выполняются, то преобразование результатов может привести к улучшению выполнения этих условий. Примерами таких преобразований
являются логарифмическое (In y), квадратичное (Jy , y2).
Логарифмическое преобразование значений y в In y, может быть полезно если однородность дисперсий неудовлетворительна. Оно также может улучшить нормальность распределения, если оно смещено вправо.
Преобразование y в .Jy можно использовать в случае, если результаты подчиняются распределению Пуассона, то есть, если они получены путем вычислений.
Преобразование y в y2 может быть использовано, если, например, доза в большей мере пропорциональна площади ингибирования зоны роста микроорганизмов, чем измеренному диаметру этой зоны роста.
Существует другая категория тестов, когда при анализе результат не может быть количественно измерен для каждого экспериментального объекта, а определяется как часть выборки у которой получен ответ на воздействие. Эта категория рассмотрена в Разделе 4.
3.1.2 ПОСТОЯННЫЕ РУТИННЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1 Wilk,
M.B. and Shapiro, S.S.
(1968).
The joint assesment of normality of several independent
samples, Technometrics
10,
825-839.
2 Bartlett,
M.S.
(1937).
Properties of sufficiency and statistical tests, Proc.
Roy. Soc. London,
Series A
160, 280-282.
3 Cochran,
W.G.
(1951).
Testing a linear relation among variances, Biometrics
7,
17-32.
При постоянном проведении количественного определения, практически отсутствует возможность систематически контролировать выполнение условий 1-3, так как ограниченное число измерений в каждом анализе может влиять на чувствительность статистических тестов. Однако специалисты по статистическому анализупоказали, что при симметричных сбалансированных анализах, небольшие отклонения от однородности дисперсий и нормальности распределения не оказывают существенного влияния на результаты количественного определения. Вопрос о применимости статистической модели следует ставить под сомнение только в том случае, если ряд полученных результатов имеет сомнительную достоверность. При этом может возникнуть необходимость выполнить новую серию предварительных исследований, как описано в Разделе 3.1.1.
В зависимости от применяемой статистической модели следует контролировать выполнение двух дополнительных условий: Для модели параллельных линий:
4А) Взаимосвязь между логарифмом дозы и результатом может быть представлено в виде прямой линии во всем диапазоне исследованных доз.
5А) При анализе прямая линия для любого испытуемого препарата параллельна соответствующей прямой линии для стандартного препарата.
Для модели угловых коэффициентов:
4В) Во всем диапазоне исследованных доз отношение между дозой и полученным эффектом для каждого препарата может быть представлено в виде прямой линии. 5В) При анализе для любого испытуемого препарата прямая линия пересекает ось y (при дозе, равной нулю) в той же точке, что и прямая линия для стандартного препарата (другими словами, при анализе графики результирующей функции эффектов всех испытуемых препаратов должны пересекаться с графиками результирующей функции эффектов стандартного препарата в одной и той же точке).
Условия 4А и 4В могут быть проверены при количественных определениях в которых использовано как минимум по три разведения для каждого протестированного препарата. Использование результатов количественного определения, полученных при одном или двух разведениях, может быть обосновано лишь в том случае, если накопленный опыт свидетельствует, что условия линейности, параллельности или совпадение точек пересечения всегда выполняются.
После получения результатов количественного определения и перед вычислением относительной активности каждого препарата, выполняется дисперсионный анализ с целью проверки выполнения условий 4А и 5А (или 4В и 5В). Для этого общую сумму квадратов делят на определенное число сумм квадратов, соответствующих каждому выполняемому условию. Оставшиеся суммы квадратов представляют собой не-исключенную (остаточную) погрешность определения. При помощи ряда F-отношений можно оценить отсутствие или наличие значимых источников вариации, для этой неис-ключенной (остаточной) погрешности определения.
Когда методика анализа провалидирована, активность каждого испытуемого препарата по отношению к стандартному может быть рассчитана и выражена как отношение активностей или преобразована в определенные единицы активности, например, в международные единицы. Также, для каждого ряда данных анализа могут быть установлены доверительные интервалы.
В Разделе 3.2. рассматриваются методики анализа, основанные на использовании модели параллельных линий, а в Разделе 3.3. - основанные на использовании модели угловых коэффициентов.
Если хотя бы одно из перечисленных пяти условий (1, 2, 3, 4А, 5А или 1, 2, 3, 4В, 5В) не выполняется, применение приведенных в данной статье методов вычисления не может быть обосновано и следует провести специальный анализ результатов количественного определения.
Аналитик не должен применять другой метод преобразования, до тех пор, пока не убедится, что невыполнение условий является не случайным, а обусловлено систематическим изменением условий испытания. В этом случае, прежде чем принять новое преобразование для постоянных (рутинных) количественных определений, следует повторить исследования, описанные в Разделе 3.1.1.
Высокое число недостоверных результатов анализа, возникающих вследствие непараллельности или нелинейности, при выполнении постоянных (рутинных) количественных определений в результате сравнения подобных материалов, чаще всего свидетельствует о неправильном планировании эксперимента и числа повторений. Обычно это обусловлено недостаточно полной идентификацией всех источников вариации, воздействующих на количественное определение, что в результате может привести к заниженной оценке неисключенной погрешности и, соответственно, к увеличению F-отношений.
В рамках конкретного количественного определения не всегда можно принять во внимание все возможные источники вариации (например, вариация в серии «изо-дня-в-день»). В этом случае доверительные интервалы повторных результатов количественных определений одного и того же препарата могут не совпадать, и следует соблюдать осторожность при оценке отдельных доверительных интервалов. Для того, чтобы получить более надежную оценку доверительного интервала, необходимо выполнить несколько независимых количественных определений, объединить полученные результаты и получить одну оценку активности и доверительный интервал (см. Раздел 6). Для контроля качества постоянных (рутинных) количественных определений рекомендуется результаты оценки угловых коэффициентов и оценки остаточной ошибки заносить в контрольные карты.
довольно высокая неисключенная (остаточная) погрешность может свидетельствовать об определенной технической проблеме. Эту ситуацию следует проанализировать и, если в ходе выполнения количественного определения выявятся нарушения, определение следует повторить. Необычно высокая неисключенная (остаточная) погрешность также может указывать на наличие случайного выброса или аналогичного результата. Эффект, достоверность которого ставится под сомнение из-за неправильного выполнения количественного определения, следует отбросить. Обоснованным также можно считать отбрасывание аномального эффекта после завершения количественного определения, если удается проследить причину выброса и убедиться, что она обусловлена нарушениями в ходе количественного определения. Произвольное отбрасывание или сохранение очевидных выбросов может оказаться серьезным источником погрешности измерения. В целом не рекомендуется отбрасывать результаты лишь на основании значимости исследования на выбросы.
Время от времени может возникать довольно низкая неисключенная (остаточная) погрешность, что приводит к тому, что F-отношения превышают критические значения. В этом случае может быть оправданным замена неисключенной (остаточной) погрешности отдельного количественного определения на среднюю неисключенную (остаточную) погрешность, полученную на основании архивных данных, зафиксированных в контрольных картах.
3.1.3 ВЫЧИСЛЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
Согласно общим принципам надлежащего планирования эксперимента на план анализа обычно накладываются следующие три ограничения. Они обеспечивают выигрыш как в простоте вычислений, так и в их точности.
а) число разведений должно быть одинаковым для каждого из тестируемых препаратов;
в) при использовании модели параллельных линий отношение двух последовательных доз должно быть всегда постоянным для всех испытаний; при использовании модели угловых коэффициентов, должна быть постоянной разница (интервал) двух последовательных доз. с) число тестируемых объектов должно быть одинаковым во всех исследованиях.
Если используемый план удовлетворяет этим условиям, то вычисления упрощаются. Формулы вычислений приведены в Разделах 3.2 и 3.3. Рекомендуется использовать программное обеспечение, разработанное специально для этих целей. Существует ряд статистических программ, при помощи которых можно легко обрабатывать планы количественных определений, приведенные в частных статьях. Не все программы могут использовать одни и те же формулы и алгоритмы, но они все должны приводить к одинаковым результатам.
Планы количественных определений, не отвечающие вышеуказанным требованиям, могут быть также допустимы и корректны. Однако, необходимые для таких вычислений формулы слишком сложны и поэтому в данной статье не приводятся. Краткое описание методов расчета приводится в Разделе 7.1. Эти методы могут также использоваться для ограниченных планов, в этом случае они эквивалентны упрощенным формулам.
Формулы для ограниченных планов, приведенные в данной статье, могут быть использованы, например, для создания специальных программ с использованием электронных таблиц. Для лучшего понимания статистики и проверки правильности результатов таких программ, могут быть использованы примеры, приведенные в Разделе 5.