60. Реакция преципитации. Компоненты. Методы постановки. Практическое применение.

РП- выпадение в осадок растворимого АГ при взаимодействии с соответствующими АТ- приципитатами в присутствии электролита. АГ м.б. прозрачный р-р белка или гаптена, различные экстракты. РП ставят несколькими методами. М-д кольцепритации: на известную сыворотку с известными преципитатами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают р-р АГ и в теч. 1ч. учитывают (+) р-ю(на границе жидкостей образуется белый диск приципитата и постепенно оседает). Так, определяют, например, АГ сибирской язвы в разных материалах. М-д прецип-ии в каппиляре: стеклянный каппиляр диаметром 1 мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыв-ку, а затем на 1/3- в р-р АГ, переворачивают неск-ко раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зерна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в каппиляре. Так определяют, например, С-реактивный белок(СРБ) при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, туберкулезе, инф. Миокарда( диагностическую сыворотку с преципитатами к СРВ получают путем иммунизации кроликов). М-д диффузной преципитации в агаровом геле: р-ры АГ и АТ помещают в разные места прозрачного геля, из которого они диффундируют, образуя при встрече приципитат в виде белых полос или линий. В м-де простой диффузии АГ диффундирует в агаре, содержащем определ. конц-ю диагнотической сыв-ки, которую предварительно вводим в незастывший агар. В м-де двойной диффузии АГ и АТ из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара. В м-де иммуноэлектрофорреза р-р неоднородного АГ сначала поддвергают фракционированию в огаровом геле под действием постоянного тока, а затем канавку в геле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сыв-кой (АТ). В результате двойной диффузии в геле образуется специфический рис. Из дуг и линий преципитата, вид от которого зависит от кол-ва и кач-ва фракций АГ и АТ.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявить белковые АГ в разведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступные для обнаружения химическим путем. Титром преципитир-й сыв-ки считают наибольшее разведение АГ, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием АГ, маленькими размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных АГ в материале от больных и из внеш. Среды, определение Igразных классов, для выявления фальсификации пищ. Продуктов, для определения видовой принадлежности крови и др. биологических примесей(суд. мед. практика).

61.Реакция лизиса.Реакция связывания комплемента(РСК).Компоненты.Практическое применение.

РСК (РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА)

1.ИНГРЕДИЕНТЫ

Пробирки, сыворотка больного, физ р-р,комплемент(сыворотка морской свинки)эритроциты барана,гемолитическая сыворотка(кролика)диагностикум

2.ПОСТАНОВКА

РЕАКЦИЯ В 2 ЭТАПА.

Параллельно ставят 1-ну опытную и 2-е контрольные пробирки:

1.контроль сыворотки пациентки(КС)к сывороткедобавляют физ р-р и комплемент,инкубируют и на 2-ом этапе добавляют гемолитическую систему(смесь эритроцитов и сыворотки кролика)инкубируют,проводят учет

2.контроль диагностикума/антигена(КА) на 1-ом этапе к диагностикуму добавляют физ р-р и комплемент,инкубируют,добавляют гемолитическую систему,инкубируют проводят учет

3.опытная пробирка(О) к сыворотке пациента добавляют диагностикум и комплемент,инкубруют, добавляют гемолитическую систему,инкубируют, проводят учет

3.УЧЕТ

КС КЛ О

А) красная прозрачная жидкость(лаковая кровь)выявлена в пробирках КС,КЛ

Б) прозрачная бесцветная жидкость и осадок на дне выявлена в пробирке О

4.ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

1. на наличие антител в опытной пробирке указывае прозрачная бесцветная жидкость с эритроцитами на дне(гемолиз эритроцитов не произошел)

2.на отсутствие антител в сыворотке пациента указывает лаковая кровь(произошел гемолиз)

5.ВЫВОД. У ПАЦИЕНТА АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ВЫЯВЛЕНЫ. . Реакция лизиса - серологический тест, основанный на растворении цельноклеточного АГ, соединенного с AT, в присутствии комплемента. В зависимости от АГ, участвующих в реакции лизиса, ее называют реакцией спирохетолиза, вибрионолиза, бактериолиза, гемолиза и т.д. AT, участвующие в реакции, соответственно называют спирохетолизинами, вибрионолизинами, гемолизинами и т.д. Комплемент проявляет литическое действие только в присутствии иммунного комплекса «клетка + лизин». Большинство м/о, за исключением холерного вибриона и трепонем, малочувствительны к литическому действию комплемента. Поэтому реакция лизиса не нашла широкого применения в лабораторной практике.

62. Реакция нейтрализации токсина анатоксином. Компоненты. Методы постановки. Практическое применение.

Р-я нейтрализации экзотоксина происходит при его взаимодействии с антитоксической сывороткой (антитела-антитоксины). В результате образовании комплекса АГ-АТ - токсин теряет свои ядовитые свойства. Р-ю нейтрализации проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов. Токсины получают путем фильтрования жидкой пит. среды или исследуемого материала, где размножались токсигенные бактерии. При обработке формалином в течение 30-45 дней при t 37°С токсин превращается в анатоксин, который используют для иммунизации животных с целью получения антитоксической сыворотки. Варианты постановки реакции нейтрализации токсина: Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение в пробирке. Используют для количественного определения токсинов или анатоксинов. Реакция нейтрализации in vivo. Для определения типа токсина его смешивают с диагностической антитоксической сывороткой и эту смесь вводят белым мышам. При нейтрализации токсина антитоксической сывороткой мыши не погибают. Реакцию нейтрализации используют для определения антитоксического иммунитета у детей при дифтерии (проба Шика) и скарлатине (проба Дика). Для этого в область предплечья внутрикожно вводят определенное количество соответствующего токсина. При наличии в организме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и р-я будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов в организме возникает воспалит. р- я на месте введения токсина. Р-я нейтрализации вирусов- используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена р-я нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если АТ соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается, и индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним. На этом же принципе основана р-я ингибиции метаболизма для идентификации миксоплазм.

63.РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ.РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ,РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ.КОМПОНЕНТЫ.ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ.

РТГА-эту реакцию ставят при диагностике заболеваний возбудители кот. Обладают гемагглютинирующими свойствами(грипп, парагрипп).

ИНГРЕДИЕНТЫ , ПОСТАНОВКА.

Реакцию ставят в 2 этапа.

1.к предварительно раститрованной сыворотке больного в лунки планшета добавляют вирусный диагностикум, инкубируют.

2. добавляют в лунки куриные эритроциты (парагрипп,эритроциты морской свинки)инкубируют проводят учет

УЧЕТ. 1.ВЕРХНИЙ РЯД ЛУНОК

А) ПУГОВКИ(осадок эритроцитов с ровными краями, занимающие 1/3дна лунки)выявлены при разведениях 1/10 – 1/120

Б) ЗОНТИКИ(осадок эритроцитов с неровными краями занимающие 2/3 дна лунки)выявлены при разведениях 1/40 – 1/320

2. А) ПУГОВКИ выявлены при разведениях 1/10 – 11/80

Б) ЗОНТИКИ выявлены при разведениях 1/160 – 1/320

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

А) на наличие антител указывает ПУГОВКА

Б) на отсутствие антител указывает ЗОНТИК

В) на титр антител указывает наиболее разведенные сыворотки, при кот. Выявляют антитела

Вывод. А)Титр антител на 7-й день = ½;Б На 14-й день=1/80; В)диагноз грипп А подтв.т.к титр увеличился в 4раза

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Эту реакцию ставят при диагностике заболеваний возбудители которых обладают цпд(цитопатическим действием)например полиомиелит.

Реакцию ставят в 2 этапа.

1.к раститрованой пробирке сыворотки 1/2- 1/4 – 1/8 и т.д. добавляют вирусный диагностикум, инкубируют.

2.в пробирки добавляют взвесь культуры культуры клеток в питательной среде(199)вазелин. Масло, инкубируют проводят учет

УЧЕТ

1-й ряд пробирок сыворотка на 7-й день заболевания

А) желт. Жидкость выявлена при разведениях 1/2 – ¼ - 1/8 – 1/16

Б) розовая жидкость выявлена при разведениях 1/32 – 1/64

2-й ряд сыворотка через 14 дн. от начала заболевания

А)желт. Жидкость выявлена при разведениях 1/2 – 1/4 - 1/8 – 1/16

Б)розов. Жидкость выявлена при разведениях 1/32 – 1/64

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

А. НА НАЛИЧИЕ АНТИТЕЛ УКАЗЫВАЕТ ЖЕЛТ. ЖИДКОСТЬ

Б. НА ОТСУТСТВИЕ АНТИТЕЛ УКАЗЫВАЕТ РОЗОВАЯ ЖИДКОСТЬ

В. На титр антител указывает наиболее разведенные сыворотки, при которых выявляют антитела

ВЫВОД.а) титр антител на 7й день заболевания=1/16

Б) титр на 14-й день=1/16

Т.к титр антител не изменился диагноз полиомиелит пациенту не подтаерждаем.

Необходимо провести диф диагностику от др. энтеровирусных заболеваний.

64. Реакции имунофлюорестенции, компоненты, практическое применение. «Флуоресцирующие антитела» представляют собой специфические иммуноглобулины, «помеченные» красителем типа флуоресцеина или родамина, флуоресцирующим при облучении ультрафиолетовым или синим светом. Прямая иммунофлуоресценция (А—аф). Вирусный антиген (А) (в виде, например, фиксированного ацетоном зараженного вирусом монослоя клеток на покровном стекле) обрабатывают конъюгированной с флуоресцеином антивирусной сывороткой {аф). Избыток ар отмывают и клетки просматривают с помощью микроскопа, снабженного сильным источником света (лампа с парами ксенона или ртути) и фильтром, задерживающим лучи всех длин волн, кроме коротковолновых. Между объективом и окуляром вводят дополнительные фильтры, которые поглощают все синие и ультрафиолетовые лучи; таким образом, препарат выглядит черным, за исключением тех мест, где флуоресцеин излучает зелено-желтый свет. Непрямая иммунофлуоресценция (А—а—гф). Для этого метода, иногда называемого методом «сэндвича», характерно то, что антивирусные антитела (а), не меченные красителем, выполняют роль «начинки в сэндвиче». Они связываются как с антигеном (А), так и с антигаммаглобулином, конъюгированным с флуоресцеином (гф), который добавляют в конце реакции. Например, если в качестве антивирусной сыворотки берут сыворотку человека в период выздоровления, то целесообразно использовать глобулин (г), полученный путем иммунизации коз или кроликов нормальным человеческим глобулином. Непрямой метод иммунофлуоресценции более чувствителен, чем прямой, и, что особенно важно в диагностике, для тестирования взаимодействия любого антигена с соответствующими антителами, образующимися в организме человека, необходим лишь один вид меченого реагента, например конъюгированный с флуоресцеином козий у-глобулин против глобулина человека. Иммунофлуоресценция комплемента (А—а—К—гф). После того как комплекс антиген—антитело свяжет комплемент, в систему вносят конъгогированнкй с флуоресцеином иммуноглобулин против комплемента. Метод сопряжен с рядом трудностей и используется не так широко, как описанные выше варианты.Иммунофлуоресценция обладает двумя основными преимуществами по сравнению с другими серологическими методами. В исследовательской работе этот метод позволяет определить, какие клетки в органе содержат вирус, и установить локализацию специфических вирусных антигенов в зараженной клетке. Несмотря на то что трудности, обусловленные неспецифической флуоресценцией, несколько задерживают широкое внедрение метода в диагностических лабораториях, он имеет большие возможности для ускоренной идентификации вируса как непосредственно в материале, полученном при биопсии или аутопсии, так и после пассирования вируса в культуре клеток.

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром  светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

.

65.ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ(ИФА).ИММУНОБЛОТИНГ(ИБ).КОМПОНЕНТЫ ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ. ИФА.

1,2 ИНГРЕДИЕНТЫ, ПОСТАНОВКА

на фарм предприятии на дно лунок планшета адсорбируют австралийский антиген(Hbs антиген)

В лаборатории/станции переливания крови в лунки наливают контрольные сыворотки и сыворотки пациентов(7- чел).инкубируют, промывают и доб-т античеловеческую сыворотку, конъюгированную с ферментом(пероксидаза).инкубируют промывают и добавляют реактив на фермент (5- аминосалициловая кислота(р-р + перекись Н 3%)инкубируют проводят учет

3. УЧЕТ

1)контрольные лунки

А)заведомо положительная сыворотка(А11)- выявлена коричневая жидкость

Б)заведомо отрицательная сыворотка(А12)- выявлена желт. Жидкость

В)исследуемые сыворотки.(желт. Жидкость выявлена в лунках А3,А4,А6)

г) коричневая жидкость в лунках,(А1,А2,А5,А7)

4.ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

1)На наличие антител к Hbs антигену указывает коричневая жидкость

2)на отсутствие антител указывает желт.

ВЫВОД. У пациентов А1, А2, А5, А7 выявлены антитела к Hbs антигену.

ИММУНОБЛОТИНГ

1.ИНГРЕДИЕНТЫ(полоски из нитроциллюлозы на кот. Путем электрофореза разделены антигены ВИЧ1 и ВИЧ2)контейнеры/ванны, исследуемые сыворотки пациентов, заведомо положительная сыворотка к ВИЧ1, заведомо положительная сыворотка к ВИ2,конъюгат античеловеческой сыворотки,реактив на фермент.

2.ПОСТАНОВКА предварительно в контейнерах инкубируют сыворотки со стрипами, затем промывают стрипы и добавляют конъюгат, вновь инкубируют и после промывки добавляют реактив, инкубируют проводят учет

3.УЧЕТ

1)КОНТРОЛЬНЫЕ СТРИПЫ

А)контроль отсутст-е поставле-й иб(№22) коричневой линии на полоске не выявлено

Б)заведомо положительная сыворотка к ВИЧ1(№23)выявлено 3 коричневы линии сверху различной окраски

Г)заведомо положительная сыворотка к ВИЧ2(№24)выявлено 2 коричневые линии в центральной части стрипа

2)ИССЛЕДУЕМЫЕ СЫВОРОТКИ(№1 - №21)

А) в нижней части всех стрипов выявлены коричн. Линии в кол- ве 1-й линии

Б)светло- коричневая линия выявлена в центральной части стрипа№5

4.ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

1)НА ПРОИЗОШЕДШУЮ РЕАКЦИЮ ИБ УКАЗЫВАЮТ

- коричн. Линия в нижней части стрипа

2)на выявление антител к ВИЧ1 указывает 3 коричневые линии в верхней части стрипа

3)на выявление антите к ВИЧ2 указывают 2 коричневые линии в центральной части стрипа

5.ВЫВОД.выявлены врачебные ошибки

А) сомнительный результат был подтвержден пациенту № (это не верно т.к ?

Б)пациента №6 обязаны были отправить на дополн. Обследование(а о пациенте №5 забыли)

66.ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ(ПЦР).КОМПОНЕНТЫ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ.

ПЦР - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм м/о. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внеш. среды (вода, почва и т.д.). Для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; онковирусов.

Метод заключается в многократном увеличении количества ( амплификации) ДНК диагносцирующего м/о. Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты: 1)ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент); 2)Праймеры - 20-30 нуклеотидных пар, комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента . 3)Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК); 4)Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК); 5) Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).