Методические указания к самостоятельной работе

1. Вопросы по теме занятия 9 для самостоятельного изучения их студентами:

1. Какие используются питательные среды для культивирова- ния анаэробов?

2. Как создаются анаэробные условия для анаэробов:

0. - физико-механические (эвакуационно-заместительный метод с использованием анаэростатов, кипячение среды, метод Перетца, посев в высокий столбик агара);

1. - химические способы поглощения кислорода в замкнутом пространстве (раствором пирогаллола, гидросульфитом натрия, применение газогенерирующих систем);

2. - биологические методы (совместное выращивание анаэробов и аэробов, использование среды Китта-Тароцци)?

3. Каковы методы выделения чистых культур анаэробов:

0. - метод Цейсслера;

1. - метод Вейнберга.

2. - метод Вейона Виньяля?

4. Что такое анаэробиоз?

5. Кто открыл анаэробные бактерии?

6. Чем отличаются облигатные анаэробы от факультативных?

7. Что такое регенерация питательной среды и как она производится?

8. Что такое размножение?

9. Что такое рост бактерий?

2. Дома студенту необходимо письменно ответить на следующие вопросы (домашняя работа сдается преподавателю на занятии):

1. Методы культивирования анаэробов (заполнить таблицу 17):

Таблица 17

Метод, среда	Условия создания анаэробиоза
Физический
Химический
Биологический
Среда Китта-Тароцци
Среда Вильсон-Блер

1. Биологические свойства микроорганизмов (заполнить таблицу 18):

Таблица 18

Группа микроорганизмов	Тип питания	Тип дыхания
Стафилококки
Клостридии
Вирусы

3. Почему бактерии рода Campylobacter и Helicobacter называют микроаэрофилами?

4. В чем сущность метода диагностики анаэробной инфекции с помощью хроматографии?

5. Написать основные виды бактерий родов Campylobacter и Helicobacter

6. Заболевания, связанные с бактериями родов Campylobacter и Helicobacter

Справочные и теоретические материалы

Культивирование анаэробов требует специальных условий, т.к. эти микробы необходимо лишить доступа свободного кислорода. В питательные среды, используемые для посева анаэробов, добавляют вещества, которые поглощают кислород из среды и снижают его концентрацию: глюкозу 1–2%, аскорбиновую кислоту – 0,08%. Все питательные среды перед посевом регенерируют, т.е. кипятят на водяной бане не менее 15 минут и быстро охлаждают, удаляя, таким образом, воздух, содержащийся в среде. Среду после посева заливают слоем вазелинового или парафинового масла, чтобы предупредить доступ кислорода. Культивируют анаэробы в бескислородных условиях. Существует несколько способов удаления кислорода: механический, химический, биологический.

Механический способ

а) Удаление воздуха механическим путем. Удаление воздуха (а, следовательно, и кислорода) проводят в специальных приборах – анаэростатах путем выкачивания. Этот прибор может быть заменен эксикатором.

б) Механическая защита от кислорода воздуха. Делают посев по методу Вейон-Виньяля в пастеровских пипетках. Для посева в чашках делают посев по методу Перетца. Для этого разводят исследуемый материал в расплавленном агаре, выливают в чашки Петри, на дно которых положены на стеклянные палочки или спички стерильные стеклянные пластинки. Между дном чашки и стеклянной пластинкой образуется капиллярная полость, куда расплавленный агар быстро затекает. Высота слоя агара под стеклом 1–2 мм, в этом слое вырастают анаэробы, в то время как над стеклом растут аэробы.

в) Замена воздуха индифферентным газом. В этом случае в анаэростат, после откачивания воздуха, нагнетают азот или, присоединив анаэростат к аппарату Киппа, вытесняют воздух с кислородом образующимся водородом.

г) Наиболее простой способ – посев уколом в высокий столбик сахарного агара.

Химический способ

Основан на способности некоторых веществ (щелочной раствор пирогаллола, гидросульфит натрия), поглощать кислород из воздуха. Засеянные чашки, или пробирки помещаю в специальные аппараты: Аристовского, Омелянского или микроанаэростат, эксикатор, туда же помещают погло­щающие вещества в чашке Петри, аппарат плотно закрывают.

Биологический способ

Основан на совместном выращивании в чашке анаэробов и аэробов – метод Фортнера. После посева чашки закрывают, заливают парафином для герметичности. Выросшие аэробы используют кислород и создают бескис­лородные условия для роста анаэробов.

В некоторых случаях, когда не требуется низкого парциального давления кислорода, кислород из воздуха можно удалить, поместив в эксикатор горящую свечу.

Среды и аппаратура для культивирования анаэробов

Среда Китта-Тароцци – представляет собой питательный бульон с 0,5% глюкозы, в который погружены кусочки печени или мяса. Перед посевом среду кипятят 20 мин., быстро остужают до 45°С и засевают сразу же, после посева в пробирку на поверхность среды наливают стерильное вазелиновое масло, чтобы защитить посев от кислорода.

Анаэростат – прибор, служащий для создания и поддержания ста­бильно анаэробных условий. Промышленность изготовляет микроанаэростаты и макроанаэростаты.

Микроанаэростат – представляет собой толстостенный металличес­кий стакан цилиндрической формы, который через вакуумную резиновую прокладку закрывают металлической крышкой. Но крышке расположены вакуумметр и патрубок для откачивания и нагнетания воздуха и газа. Крышку прижимают к краям стакана винтом с дугообразным хомутом.

Макроанаэростат – это водяной термостат, внутри которого вмонтирован анаэростат – толстостенный металлический котел цилиндрической формы, герметически закрывающийся крышкой со стеклом для наблюдения за ростом микробов. На верхней стенке анаэростата находятся вакуумметр и патрубок для откачивания воздуха. Рабочая камера имеет съемные полочки для чашек и пробирок. В макроанаэростате вакуум должен быть доведен до 3–10 мм ртутного столба.

Эксикатор – стеклянный толстостенный сосуд, закрывающийся крышкой, которую можно притереть к краям эксикатора. В крышке имеется патрубок с краном для откачивания или нагнетания воздуха.

Посев по Фортнеру. Кровяной питательный агар разливают в чашки Петри толстым слоем, после застывания по диаметру агар вырезают в виде узкой щели. На одну половину чашки засевают культуру аэробного микроба, жадно поглощающего кислород (кишечную палочку, чудесную палочку), а на другую половину засевают исследуемый материал. Чашку закрывают, заливают парафином. Аэробные бактерии быстро используют кислород воздуха в герметически закрытой чашке, затем начинают размножаться анаэробы, через 24–48 часов чашку открывают и из отдельных колоний анаэробов выделяют чистую культуру.

Посев по Вейон-Виньялю в пастеровских пипетках. Пастеровские пипетки представляют собой длинные трубки (20–25 см) диаметром около 5 мм, приготовленные из легкоплавкого стекла. Один конец пипетки открыт, а другой вытянут в виде капилляра и запаян. Перед стерилизацией в широкий конец вставляют вату. Исследуемый материал разводят полужидким агаром с небольшим содержание глюкозы, затем из каждого разведения насасывают агар в стерильную пастеровскую пипетку, предварительно обломив запаянный конец капилляра, и избегая попадания пузырьков воздуха. Затем капилляр запаивают и пипетки помещают в термостат. Через 24–48 часов в среде можно обнаружить ясно видимые колонии бактерий в виде пушинок, комочков ваты, зерен чечевицы и т.д. Нужные колонии можно извлечь, распилив трубку.

Выделение чистых культур анаэробных бактерий

1 этап. Накопление материала.

Исследуемый материал, предварительно прогретый в течение 15 мин. при 80°С для уничтожения вегетативной флоры (споры анаэробов при этом не гибнут), засевают на среду Кита-Тароцци и ставят в термостат.

2 этап. Выделение чистой культуры.

После суточного инкубирования в результате роста микробов среда мутнеет, иногда в ней видны пузырьки газа. Выделение культуры проводят или по методу Цейсслера или по методу Вейнберга.

Метод Цейсслера. Каплю материала со среды Китта-Троцц помещают в чашку с кровяным сахарным агаром, тщательно распределяют его по поверхности среды шпателем, затем этим же шпателем делают посев во второй и третьей чашке. Сутки инкубируют чашки в термостате в анаэробных условиях. На следующий день по форме колоний и морфологии микробов, изученной в мазках, окрашенных по Граму, ориентировочно определяют вид бактерий, изученные колонии пересевают на среду Кита-Тароцци для выделения чистой культуры и точного определения видов микроорганизмов.

Метод Вейнберга. 1–2 капли материала со среды Кита-Тароцци вносят в пробирку с МПБ для разведения. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3–5 узких пробирок с сахарным МПА, предварительно расплавленным и прокипяченным в течение 20 мин и остуженным до 50°С, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды, при этом агар застынет и зафиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток. Инкубируют в анаэробных условиях. Через сутки отбирают колонии, на уровне колонии пробирку распиливают, колонию отсасывают пипеткой и переносят в среду Китта-Тароцци для накопления и идентификации.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Методы выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов и их идентификации

2. Методы культивирования культур анаэробных микроорганизмов

Уметь:

1. Читать результаты микробиологического исследования

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА. Распространенность микробов в природе. Микрофлора воды. Микрофлора воздуха. Понятие о микробном числе, титре, индексе.