Литература

1. Бакун, О. В. Гормональные и иммунологические изменения у девочек с пубертатными маточными кровотечениями / О. В. Бакун // Бук. мед. вестник. — 2004. — Т. 8, № 2. — С. 18–20.

2. Богданова, Е. А. Особенности гормонального статуса у девочек с маточным кровотечением пубертатного периода / Е. Богданова, Т. Глыбина, Е. Сибирская // Проблемы репродукции. — 2010. —Т. 16, № 3. — С. 35–39.

3. Шевченко, В. Н. Гормонально-метаболический статус девочек с инвертированным пубертатом / В. Н. Шевченко // Педиатрия, акушерство и гинекология. — 2009. — Т. 71, № 2. — С. 74–75.

4. Redmond, J. P. Thyroid dysfunction and women's reproductive health / J. P. Redmond // Thyroid. — 2004. — № 14 (Suppl 1). — Р. 5–15.

5. Strickland, J. L. Abnormal uterine bleeding in adolescents / J. L. Strickland, J. W. Wall // Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. — 2003. — Vol. 30, № 2. — P. 321–335.

УДК: 612.015.:514.1+577.1.-574.995.17

Определение гепарина в биологических объектах

Андрияка А. А., Борисенко Е. А., Корж А. В.

Научный руководитель: д. м. н., проф. С. В. Выдыборец

Национальная медицинская академия

последипломного образования им. П. Л. Шупика,

Киевский областной онкологический диспансер,

г. Киев, Украина

Черниговская областная станция переливания крови

г. Чернигов, Украина

Введение

В последнее время в клинической практике особое внимание уделяется изучению физиологически активных веществ (ФАВ) при различных состояниях [3]. Это обусловлено, прежде всего, их значительной биологической активностью, влиянием на возникновение, развитие и течение биохимических изменений в организме. Наше внимание привлекло такое ФАВ как гепарин. Учитывая значительную физиологическую активность гепарина, его участие во многих патофизиологических процессах, нами была поставлена цель— применить электрофоретический метод определения количественного содержания гепарина в пробах биологических субстратов, который позволял бы из смеси мукополисахаридов плазмы крови виделять только гепарин.

Материалы и методы исследования

1. Полиакриламидный гель, в состав которого входит 22 %-ный раствор 0,1 М солевой фосфатсодержащей буферной смеси рН 7,4–7,6.

2. 0,06 М натрий-барбитуратный буфер рН 8,6.

3. 0,1 М солевая фосфатсодержащая буферная смесь рН 7,6.

4. 5 % раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в 2 Н соляной кислоте.

5. 0,1 Н раствор NаОН.

6. Фиксирующая смесь: метанол : вода : уксусная кислота = 10:10:1.

7. Краситель: 0,1 %-ный раствор толуидинового синего в 3 % уксусной кислоте.

8. 3 % раствор уксусной кислоты.

9. Стандарт коммерческого препарата гепарина 50 ЕД/мл.

10. Эллюирующий раствор: смесь 0,1 М СаСl₂: этанол (0,3 мл : 0,7 мл).

11. Аппарат для горизонтального гельэлектрофореза «АГГЭ-3».

12. Фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М.

13. Центрифуга лабораторная на 3000 об/мин.

Ход определения. Берут биологический образец, в котором необходимо определить содержание гепарина, например, плазму, сыворотку, биологическую ткань, высушивают при температуре 60 °С, а затем измельчают. Навеску пробы 50 мг экстрагируют 3 мл солевой буферной фосфатной смесью при рН 7,6 на протяжении 2-х часов при температуре 60 °С. Два мл экстракта смешивают с равным объемом 5 %-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты для осаждения мукополисахаридов. После преципитации последних пробу центрифугируют. Полученный осадок мукополисахаридов растворяют несколькими каплями 0,1 Н раствора NаОH и доводят объем до 1 мл барбитуратным буфером рН 8,6. Далее 0,02 мл этого раствора вносят в лунки, содержащие полиакриламидный гель.

Проводят электрофорез, используя барбитуратный буфер рН 8,6 при напряжении 140–180 В и силе тока 20–40 мА на протяжении 30–40 мин. В качестве стандарта используют 0,5 ЕД гепарина (0,00385 мг), которые проводят через все этапы исследований. После окончания электрофоретического выделения гепарина, гелевую пластину помещают в фиксирующий раствор на 10–15 мин., а далее на 15–20 мин. — в раствор красителя. При этом на синем фоне окрашенной гелевой пластины проявляются пурпурного цвета зоны локализации гепарина. Затем гелевые пластины отмывают в 3 %-ном растворе уксусной кислоты, вследствие чего происходит изменение цвета этих пятен на сине-фиолетовый. Выделенный таким образом гепарин подлежит количественной оценке денситометрически, или путем колориметрической процедуры, которая нами и применялась. Соответственно уровню электрофоретической миграции пятна гепарина-стандарта и исследуемые зоны вырезали и экстрагировали, помещая их в 3 мл эллюирующего раствора. Полученные эллюаты фотоколориметрировали на ФЭК-56 М в кюветах с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 597 ± 10 нм. Количество гепарина в пробе оценивали относительно стандарта (мкг/г).

Результаты и их обсуждение

Гепарин как ФАВ является высокосульфатированным мукополисахаридом и содержится почти у всех тканях и жидкостях человека. Для его экстракции мы использовали солевую буферную смесь с физиологическим значением рН, что позволило экстрагировать физиологически активные формы ФАВ. Смешивание экстракта с фосфорно-вольфрамовой кислотой приводит к осаждению всех мукополисахаридов и белков. Примененная электрофоретическая процедура выделения гепарина из раствора биосубстрата позволяет выделять его из всех мукополисахаридов, которые есть в наличии в биологическом образце. Данные об этом приведены в таблица 1.

Таблица 1 — Содержание гепарина в некоторых биологических субстратах (М ± m) (мкг/г)

Объект исследования	Количество исследований (n)	Содержание гепарина
Кожа морской свинки	30	45,4 ± 0,04
Кожа человека	88	20,7 ± 0,2
Сыворотка крови человека	10	30,7 ± 3,12
Плазма крови человека	10	23,4 ± 0,79
Эритроциты человека	10	21,7 ± 2,03

Выводы

Выделенное из биологического субстрата вещество является гепарином, который имеет высокую электрофоретическую миграционную способность, что позволяет выделять его из смеси мукополисахаридов. Чувствительность метода составляет 0,05 ЕД (не менее 0,3 мкг). Метод количественного определения гепарина может быть использован в клинической практике для изучения изменений его содержания при различных патологических состояниях, а полученные результаты можно использовать для сравнительной характеристики при изучении показателей в динамике.