Вопросы к лабораторной работе «Цветные реакции на белки»

1. Какие цветные реакции являются универсальными?

2. На чем основана биуретовая реакция?

3. Какими цветными реакциями можно доказать наличие в составе белка цистеина, аргинина, тирозина?

Лабораторная работа № 2 реакции осаждения белков

Растворы белков, как и все растворы высокомолекулярных соединений, обладают двойственностью: по сути являются истинными растворами, поскольку частицами в этих растворах являются отдельные молекулы белка, но проявляют свойства коллоидных растворов, так как размеры макромолекул белка составляют от 1 до 100 нм, т.е. соизмеримы с коллоидными частицами. Устойчивость данных растворов, также как и коллоидных, обусловлена двумя факторами – зарядом и гидратной оболочкой, состоящей из ориентированных в определенной форме в пространстве молекулводы. Растворы белков образуются самопроизвольно (не нужен стабилизатор, в отличие от коллоидных растворов). Возникновение заряда на молекуле белка связано с диссоциацией собственных ионогенных групп.

Растворыбелковотличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающихгидратацию,белкилегко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении крастворубелкалюбых водоотнимающих средств (спирт,ацетон, концентрированныерастворынейтральныхсолейщелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаетсядегидратациямолекулбелкаи их выпадение в осадок. В этом случае наблюдается обратимое осаждение, белки не подвергается глубоким изменениям, сохраняются их нативные (первоначальные свойства) и полученные осадки белков снова могут быть растворены в исходном растворителе.

В случае необратимого осаждения белков происходят изменения в структуре молекулы – изменяется третичная и вторичная структура, при этом макромолекулы белков теряют свои нативные свойства.

Техника безопасности

1. Соблюдайте особую осторожность при работе с концентрированными серной, соляной и азотной кислотами, с растворами трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот, с 10% раствором щелочи.

2. Будьте внимательны при нагревании растворов.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СЕРНОКИСЛЫМ АММОНИЕМ (ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ)

Реактивы: р-р яичного белка,

насыщенный р-р (NH₄)₂SO₄,

порошок (NH₄)₂SO₄

При добавлении к водным растворам белков нейтральных солей щелочных металлов (NaCl, Na₂SO₄, KCl), солей аммония ((NH₄)₂SO₄, NH₄Cl) белки выпадают в осадок. Поскольку свободной воды (воды, не испытывающей воздействия ионов) в растворе полиэлектролитов нет, то гидратация ионов солей идет за счет снятия гидратной оболочки с молекулы белка.

Ход работы: В пробирку наливают 2-3 мл р-ра белка, добавляют равный объем насыщенного р-ра (NH₄)₂SO₄ и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в р-ре. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

Для осаждения альбуминов к фильтрату добавляют порошок (NH₄)₂SO₄ до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока порошок не будет растворяться. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Если произошло полное осаждение белков, она должна быть отрицательной.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СПИРТОМ

Органические растворители понижают устойчивость растворов белков за счет следующих процессов: они снимают гидратную оболочку с молекулы белка; уменьшают заряд на белковой молекуле, т.к. обладают низкой диэлектрической постоянной и поэтому их добавка к раствору белка снижает диэлектрическую постоянную этого раствора.

Осаждению белков спиртом способствует присутствие электролитов (например, хлористого натрия) в растворе, в этом случае осадок образуется полнее и быстрее. Ионы соли связываются молекулами белка и снимают их заряд.

Осаждение белков спиртом обратимо, если воздействие реагента было кратковременным и процесс проводили без нагревания. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации.

Реактивы: р-р яичного белка,

этиловый спирт,

порошок NaCl

Ход работы. В пробирку налить 1-2 мл р-ра яичного белка, добавить немного порошка NaCl ( на кончике шпателя) и взболтать до растворения. По каплям прилить 4-6 мл этилового спирта, сильно взболтать. Через 5-8 мин выпадает осадок белка. Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки (с осадком) в другую, добавляют несколько мл дистиллированной воды. Концентрация спирта падает и белок растворяется.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ.

Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Поэтому белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например, ртутными солями. Белок ограничивает всасывание тяжелого металла, образуя с ним нерастворимые комплексы. Но в случае некоторых солей (соли меди, свинца, цинка) образующиеся осадки растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции избытка ионов металла поверхностью комплекса измененного белка с металлом, в результате чего он переходит в раствор. Подобное явление наблюдается при добавлении достаточного количества хлористого натрия, который вызывает растворение осадка ртутного соединения белка.

Реакции осаждения белков солями тяжелых металлов идут полно и ими пользуются не только для выделения белков из растворов и биологических жидкостей, но и для освобождения их от белков.

Реактивы: раствора яичного белка; 7% раствор сернокислой меди;

5% раствор уксуснокислого свинца;

5% раствор азотнокислого серебра.

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель 1% раствора яичного белка и по 2-3 капли : в первую - 7% раствора сернокислой меди, во вторую - 5% раствора уксуснокислого свинца, в третью - 5% раствора азотнокислого серебра. Наблюдается образование осадка во всех трех пробирках.

В первую пробирку добавляют еще 5-10 капель раствора сернокислой меди, во вторую - 5-10 капель уксуснокислого свинца, в третью - 5-10 капель азотнокислого серебра.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами (кроме ортофосфорной кислоты) объясняется как явлениями дегидратации белковых частиц и нейтрализации их зарядов, так и рядом других причин (денатурацией, образованием солей).

В избытке серной или соляной кислот, а также при их длительном воздействии, выпавший осадок денатурированного белка растворяется, по-видимому, за счет перезарядки белка и частичного гидролиза. В избытке азотной кислоты этого растворения не происходит (возможно, сопутствующий нитрат-ион мешает перезарядке белковой молекулы).

Реактивы: р-р белка;

конц. растворы соляной и азотной кислот.

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10-15 капель концентрированной соляной и азотной кислот. Затем, наклонив пробирки под углом 45, осторожно по стенке пробирки (чтобы жидкости не смешались) наливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев жидкости появляется осадок белка в виде тонкой пленке. Осторожно встряхивая пробирки, обнаруживаются растворение осадка белка.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ.

Органические кислоты необратимо осаждают белок из растворов. Механизм осаждения белков органическими кислотами связан с дегидратацией молекулы белка и снятием заряда.

Трихлоруксусная кислота (CCl₃COOH) является очень чувствительным и специфическим реактивом на белок и широко применяется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови), поскольку осаждает только белки. Продукты распада белков не осаждаются, они остаются в растворе. Преимуществом данного метода является также то, что трихлоруксусная кислота легко устраняется из фильтрата кипячением.

Реактивы: р-р яичного белка;

трихлоруксусная кислота, 10%-ный р-р.

Ход работы: В пробирку наливают 2 мл раствора белка и добавляют 5-8 капель 10%-ного р-ра трихлоруксусной кислоты.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ НАГРЕВАНИИ.

Почти все белки денатурируют при нагревании до температуры от 50 С до 55 С и выше. Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства и растворимость. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка. Наиболее полное осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, т.е. при такой величине рН, когда молекулы белка наименее устойчивы.

Реактивы: раствор яичного белка;

10% раствор уксусной кислоты,

насыщенный раствор хлорида натрия;

10% раствор гидроксида натрия

В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1% раствора яичного белка.

Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора).

К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопьевидного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.

К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.

К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.

К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.