Дифениламиновая проба (реакция Дише)

Метод основан на способности дезоксирибозы ДНК образовывать соединения синего цвета с дифениламином при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной и концентрированной серной кислот. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.

Ход работы: К 10 каплям гидролизата приливают 0,5–1 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 15–20 минут. Отмечают характерное окрашивание. Для приготовления дифениламинового реактива 1 г дифениланилина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.

Проба Троммера

Эта проба, как и две последующих, основана на способности рибозы и дезоксирибозы, имеющих свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать в щелочной среде окисные формы металлов (Cu, Fe, Bi) до закисных, а закисные – до свободного состояния. Сахара же в этих условиях дают различные продукты окисления.

Проба Троммера основана на реакциях:

Избыток CuSO₄ мешает реакции, т. к. ведет к образованию большого количества Cu(OH)₂, который при нагревании распадается с образованием черного осадка CuO:

Ход работы К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30 %-го раствора NaOH и несколько капель 7 %-го раствора CuSO₄ до появления неисчезающей мути Cu(OH)₂. При нагревании до кипения выпадает черный осадок CuOH или красный осадок Cu₂O.

Реакция Толленса

Реакция Толленса является специфичной для пентоз. Она обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с HCl. При этом образуется продукт конденсации красного цвета.

Ход работы. В пробирку вносят 5–7 капель гидролизата, 2–3 капли 0,5 %-го раствора флороглюцина в концентрированной HCl и кипятят в течение 1 минуты.

Наблюдают за изменением окраски.

МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ

Приготовление молибденового реактива

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 7,5 г молибдата аммония и добавляют 100 мл 32 %-го раствора HNO₃ плотностью 1,2 г/см³.

Ход работы. В пробирку вносят 5 капель гидролизата дрожжей, добавляют 10–20 капель молибденового реактива и кипятят в течение нескольких минут. При охлаждении пробирки под струей воды выпадает кристаллический осадок фосфорной соли молибдата аммония лимонно-желтого цвета:

Вопросы к лабораторной работе

«Нуклеопротеиды»

1. Как определяется белковая природа нуклеопротеидов?

2. Что образуется при полном гидролизе нуклеопротеидов?

3. Что такое нуклеозиды?

4. Что такое мононуклеотиды?

5. Какие азотистые основания входят в состав нуклеиновых кислот?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови.

Техника безопасности

1. Соблюдайте особую осторожность при работе с раствором Люголя (йода), с раствором перекиси водорода

2. Будьте внимательны при нагревании растворов.

Опыт № 1. Амилаза слюны

Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала или гликогена.

Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл 0,2 %-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны. Содержимое перемешивают и пробы помещают в водяную баню (37^оС) на 15 минут.

В обе пробирки добавляют по 5 капель раствора Люголя (йода). В пробирке со слюной (амилазой) раствор не дает реакции на полисахарид, а в пробирке без слюны образуется сине-фиолетовое окрашивание.

Опыт №2. Липаза поджелудочной железы

Липаза гидролизует жиры на глицерин и жирные кислоты, количество которых можно определить титрованием щелочью.

Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл растительного масла, 4 мл дистиллированной Н₂О, 5 мл 1%-го раствора NaHCO₃. Содержимое энергично встряхивают до образования эмульсии. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из пробирок (опыт) - 1 мл липазы, а в другую (контроль) - 1 мл Н₂О. Содержимое тщательно перемешивают и ставят в термостат (37^оС) на 15-20 минут. Вследствие образования жирных кислот в ходе реакции и нейтрализации ими щелочной среды раствор в пробе с липазой становится менее окрашенным или обесцвечивается, а в пробе без липазы не изменяется.

Опыт №3. ПЕПСИН

Пепсин, фермент желудочного сока, гидролизует белки до пептидов и аминокислот.

Ход работы. В две пробирки вносят несколько мл раствора белка (альбумина) и легким подогревом на спиртовке или электроплитке денатурируют его. Пробы охлаждают до комнатной температуры и в одну из них добавляют раствор пепсина, а в другую - 1 мл Н₂О. Обе пробы помещают в термостат (37^оС) на 20 минут, после чего сравнивают результаты.

Опыт №4. КАТАЛАЗА

Каталаза инактивирует перекись водорода, разлагая ее на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂ = 2Н₂О + О₂.

Перекись водорода образуется в некоторых окислительно – восстановительных процессах при восстановлении молекулярного кислорода. Это вещество является сильным клеточным ядом, т.е. обладает цитотоксическим действием. Из перекиси водорода образуется гидроксильный радикал - ОН - высокореакционноспособный оксидант. Таким образом, каталаза, удаляя этот ядовитый продукт, защищает биохимические системы клетки от неконтролируемых самопроизвольных окислительных процессов. Этот фермент содержится в эритроцитах, в клетках печени и других тканей.

Ход работы. В две пробирки вносят по 2 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода, в одну из проб добавляют 1 каплю крови и перемешивают. В пробе с кровью (каталазой) вследствие выделения кислорода наблюдается интенсивное образование пузырьков.