Инструкция к практическому занятию «Иследование окислительного фосфорилирования и синтеза атф. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования».

РАБОТА №1: «Изучение активности малатдегидрогеназы»

Принцип метода: малатдегидрогеназа окисляет яблочную кислоту. В качестве конечного акцептора атомов водорода используется 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИ). Если фермент активен, то окраска ослабевает.

Материальное обеспечение:

фосфатный буфер рН=7,4, раствор яблочной кислоты, раствор 2.6 –ДХФИ, суспензия митохондрий, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

Содержимое пробирок Контроль Опыт

1. Фосфатный буфер рН=7,4 1,0 мл 1,0 мл

2. Раствор яблочной кислоты (малат) 0,5 0,5

3. Раствор 2,6-дхфи 0,5 0,5

4. Суспензия митохондрий - 0,5

5. Прокипяченная суспензия митохондрий 0,5 -

Инкубация при комнатной температуре10 минут.

Результаты (окраска).

ВЫВОДЫ:

РАБОТА №2. Изучение активности сукцинатдегидрогеназы

Принцип метода: Сукцинатдегидрогеназа окисляет янтарную кислоту. Конечным акцептором ионов водорода служит 2,6-ДХФИ. Если фермент активен, окраска исчезает.

Материальное обеспечение:

буферный раствор рН=7,4, сукцинат, раствор 2.6 –ДХФИ, суспензия митохондрий, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

Содержимое пробирок Контроль Опыт

1. Буферный раствор рН=7,4 1,0 мл 1,0 мл

2. Сукцинат 0,5 0,5

3. Раствор 2,6-дхфи 0,5 0,5

4. Суспензия митохондрий - 0,5

5.Прокипяченная суспензия митохондрий 0,5 -

_____________________________________________________________________________

Инкубация при комнатной температуре 10 минут.

Результаты (окраска).

ВЫВОДЫ:

РАБОТА № 3. Изучение реакций окислительного фосфорилирования

Принцип метода При окислении различных субстратов в дыхательной цепи высвобождается энергия, часть которой используется на реакцию фосфорилирования АДФ неорганическим фосфатом: АДФ + Н₃РО₄ + энергия = АТФ + Н₂О.

Степень окислительного фосфорилирования (энергетическая ценность субстратов) определяется по убыли неорганического фосфата (коэффициент Р/О =1- 3). Используя различные субстраты (яблочная, янтарная, аскорбиновая кислоты) определить степень окислительного фосфорилирования. Содержание фосфорной кислоты определяют в реакции с молибдатом аммония и редуцирующим раствором аскорбиновой кислоты по интенсивности окраски образующейся молибденовой сини.

Материальное обеспечение:

инкубационная смесь, физиологический раствор, раствор яблочной кислоты, раствор янтарной кислоты, раствор аскорбиновой кислоты, суспензия митохондрий, раствор ТХУ, раствор молибдата аммония, редуцирующий раствор Фиске и Субарроу, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 4-х пробирках (контроль и 3 опыт) в соответствиии со схемой постановки:

Содержимое пробирок Контроль О п ы т

________________________________

1 2 3

1. Инкубационная смесь 1,0 1,0 1,0 1,0

2. Физиологический раствор 0,5 - - -

3. Раствор яблочной кислоты - 0,5 - -

4. Раствор янтарной кислоты - - 0,5

5. Раствор аскорбиновой кислоты - - - 0,5

6. Суспензия митохондрий 0,5 0,5 0,5 0,5

Инкубация 10 минут при комнатной температуре, затем добавляем:

7. Раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ)1,0 1,0 1,0 1,0

8. Раствор молибдата аммония 0,5 0,5 0,5 0,5

9. Редуцирующий раствор Фиске и

Субарроу 0,5 0,5 0,5 0,5

Инкубация 10 минут.

Результаты (интенсивность окраски по четырехбальной шкале).

Коэффициент Р/О

ВЫВОДЫ:

РАБОТА №4 Изучение влияния 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) на окислительное фосфорилирование.

Принцип метода: 2,4-ДНФ является разобщителем фосфорилирования сопряженного с окислением. Об окислительном фосфорилировании судят по убыли в инкубационной среде неорганического фосфата, который определяется, как описано в работе №3.

Материальное обеспечение: раствор яблочной кислоты, раствор 2.4 ДНФ, суспензия митохондрий, раствор ТХУ, раствор молибдата аммония, редуцирующий раствор, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

Содержимое пробирок Контроль Опыт

1.Раствор яблочной кислоты 0,5 0,5

2.Раствор 2,4-ДНФ - 0,5

3.Суспензия митохондрий 0,5 0,5

Инкубация 10 минут при комнатной температуре.

4.Раствор Т Х У 1,0 1,0

5.Раствор молибдата аммония 0,5 0,5

6.Редуцирующий раствор 0,5 0,5

Результаты: (интенсивность окраски).

ВЫВОДЫ:

Подпись преподавателя:

Приложение 1