Инструкция к практическому занятию Работа №1 «Количественное определение белка биуретовым методом»

Принцип метода: Метод основан на способности пептидных связей белков образовывать с ионами Си+² в щелочной среде соединение фиолетового цвета, интенсивность которого пропорциональна содержанию белков в растворе.

Материальное обеспечение: сыворотка крови, 3% раствор едкого натра, реактив Бенедикта, пипетки, пробирки, штативы, ФЭК.

Ход работы:

1. В пробирку налейте 1 мл сыворотки крови.

2. Добавьте 1 мл 3% №аОН и 0,2 мл реактива Бенедикта.

3. Раствор в пробирке перемешайте и оставьте на 15 минут.

4. Через 15 минут раствор фотоколориметрируйте на ФЭКе при зеленом светофильтре.

5. В тетрадь запишите оптическую плотность (Е) раствора .

6. Концентрацию белка в г/л определите по калибровочной кривой.

Нормальное содержание белка в сыворотке крови составляет 65-85 г/л.

Калибровочная кривая:

Е

С (г/л)

Результаты:

ВЫВОД:

Работа №2 «Доказательства белковой природы ферментов»

Используя цветные реакции, можно обнаружить присутствие белков в растворах и установить аминокислотный состав. Существует 2 типа цветных реакций:

1. Универсальные на все белки (биуретовая и нингидриновая )

2. Специфические на определенные аминокислоты (например, ксантопротеиновая – на ароматические аминокислоты)

Биуретовая реакция.

Принцип метода: Метод основан на способности пептидных связей белков образовывать с ионами Си+² в щелочной среде соединение фиолетового цвета, интенсивность которого пропорциональна содержанию белков в растворе.

Материальное обеспечение: пробирки, пипетки, штатив, растворы белков, 3% раствор едкого натра, реактив Бенедикта.

Ход работы:

1. Возьмите 3 прибирки.

В первую налейте 1 мл раствора яичного альбумина.

Во вторую налейте 1 мл раствора пепсина.

В третью налейте 1 мл раствора амилазы.

2. Во все пробирки добавьте по 1 мл 3% рствора NаОН и по 0,2 мл реактива Бенедикта.

3. Перемешайте и наблюдайте окраску.

Появление фиолетовой окраски в пробирках свидетельствует о наличии белка.

Нингидриновая реакция.

Принцип метода: ά – аминокислоты свободные , а также входящие в состав пептидов и белков при кипячении с водным раствором нингидрина дают комплексные соединения синего или сине-фиолетового цвета.

Материальное обеспечение: пробирки, пипетки, штатив, растворы белков, 0,5% раствор нингидрина.

Ход работы:

1. Возьмите 3 прибирки.

В первую налейте 1 мл раствора яичного альбумина.

Во вторую налейте 1 мл раствора пепсина.

В третью налейте 1 мл раствора амилазы.

2. Во все пробирки добавьте по 0,5 мл 0,5% раствора нингидрина.

3. Осторожно прокипятите растворы в течение 1-2 минут и наблюдайте окраску.

Появление розово-фиолетового окрашивания, переходящего со временем в синее, свидетельствует о присутствии ά – аминокислот.

Ксантопротеиновая реакция.

Принцип метода: ароматические аминокислоты свободные, а также входящие в состав пептидов и белков при нагревании с азотной кислотой образуют нитросоединение желтого цвета, переходящего в оранжевый при добавлении щелочи.

Материальное обеспечение: пробирки, пипетки, штатив, растворы белков, концентрированная азотная кислота, 20% раствор едкого натра.

Ход работы:

1. Возьмите 3 прибирки.

В первую налейте 1 мл раствора яичного альбумина.

Во вторую налейте 1 мл раствора пепсина.

В третью налейте 1 мл раствора амилазы.

2. Во все пробирки добавьте по 5 капель концентрированной азотной кислоты.

3. Осторожно нагрейте растворы и наблюдайте окраску.

4. Охладите пробирки, добавьте по 0,5 мл 20% раствора NаОН и наблюдайте изменение окраски.

При наличии ароматических аминокислот появляется желтое окрашивание, которое после охлаждения раствора и добавления раствора едкого натра переходит в оранжевое.

Полученные результаты занесите в таблицу.

Результаты реакций:

№ пробирки	Исследуемый р-р	Окраска растворов в реакциях
		биуретовой	нингидриновой	ксантопротеиновой
1	Яичный белок
2	Пепсин
3	амилаза

ВЫВОДЫ:

Подпиись преподавателя: